苹果抗轮纹病种质资源和基因筛选以及NO介导的防御响应

论文摘要

苹果（Malus domestica B.）是世界上最重要的鲜食和加工果品之一,在我国,轮纹病是侵害苹果枝干和果实的重要病害,已成为我国苹果生产上的突出问题。为了更好地利用我国轮纹病抗病种质资源,培育抗轮纹病品种,本文利用轮纹病菌接种鉴定的方法对苹果轮纹病抗病种质资源进行了鉴定和筛选,并对苹果轮纹病抗性在杂交群体中的遗传分离规律进行了分析,同时,对苹果材料对轮纹病侵染的抗性响应以及抗性基因分离进行了研究。主要结果如下:1.苹果轮纹病抗病种质资源评价和筛选通过人工接种的方法,对51份苹果野生种质资源、24份砧木种质资源和95份品种种质资源进行了轮纹病抗性评价,从中筛选出了1份轮纹病免疫种质资源和14份高抗种质资源。2.苹果轮纹病抗性的遗传规律利用以富士为亲本的6个正反交杂交组合对苹果轮纹病抗性的遗传规律进行研究,共对1082株实生树的枝干轮纹病抗性和318株实生树的果实轮纹病抗性进行了调查统计,表明苹果枝干和果实轮纹病的抗性由核主效基因控制,与细胞质无明显相关。3. SNP、MeJA、SA和CaCl2四种激发子诱导富士苹果对轮纹病病菌侵染的防御响应富士苹果果实经硝普钠（SNP）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、氯化钙处理后再接种轮纹病菌（Botryosphaeria berengriana. f sp. piricola）,各处理对防止轮纹病菌对果实的侵染及扩展均具有一定的效果,烂果率和烂果面积分别比对照明显减少,PAL、SOD、POD及PPO活性均有不同程度的提高,以MeJA和SNP处理效果最为明显。4. NO介导轮纹病菌激发子对苹果细胞悬浮系的防卫响应轮纹病菌激发子可显著激发苹果细胞悬浮系NO的产生,L-NAA、PTIO抑制细胞内NO的产生。轮纹病菌激发子显著增加细胞内H2O2的水平,但SNP处理不能提高细胞内H2O2的水平。细胞内H2O2水平的提高主要是由激发子和NO协同作用的结果,植保素、MDA含量及PAL活性的提高主要受NO的诱导,但也存在其它的诱导途径。5.茉莉酸甲酯诱导苹果细胞悬浮系的防卫响应苹果细胞悬浮系经MeJA处理后,明显诱发了NO和H2O2信号分子,而SNP单独处理不能提高H2O2水平;细胞内NO的生成以及PAL酶活性、植保素和丙二醛（MDA）含量的提高,均能够被L-NAA和PTIO抑制;此结果表明MeJA激发了NO的生成,而细胞内H2O2水平的提高则是MeJA和NO协同作用的结果,植保素和MDA含量以及PAL活性的提高主要受NO的诱导。茉莉酸甲酯经常被作为诱导植物抗病反应的激发子,而一氧化氮（NO）和过氧化氢（H2O2）则是抗病反应相关的信号分子。6.抑制消减杂交（SSH）显示苹果轮纹病侵染响应基因的差异表达选取杂交组合锦红×富士的抗病和感病后代,将它们的一年生枝条接种轮纹病菌后取样,构建基因池用于SSH分析。结果表明,SSH分析共获得151个阳性克隆,反向Northern杂交表明,其中11个为假阳性。通过BLASTx和BLASTn进行同源比较,发现抗病文库中有21个已知基因可能与抗病相关,主要与胁迫响应、信号传导、激素调节、初生与次生代谢、细胞分裂和生长等相关;感病文库中有47个已知基因可能与感病相关,主要是初生与次生代谢相关的基因,其次是与细胞分裂和生长相关的基因,其余与胁迫诱导、信号传导和激素调节等有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 抗病遗传与抗性机理
• 1.2 基因的分子标记
• 1.3 遗传图谱的构建
• 1.4 植物的抗病响应机制
• 1.5 植物抗病基因的分离与克隆
• 1.6 植物抗病相关防御酶及其基因研究
• 1.7 NO在植物抗性响应的作用
• 1.8 苹果轮纹病研究进展
• 1.8.1 轮纹病菌生物学特性、发病症状与发生规律
• 1.8.2 轮纹病菌在苹果枝干及果实上的侵入途径
• 1.8.3 品种抗病性
• 1.9 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验试剂及仪器
• 2.1.1 SSH 文库构建
• 2.1.2 斑点杂交
• 2.1.3 耗材
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 试材来源地土壤营养状况
• 2.2.2 菌种来源
• 2.2.3 杂种实生苗
• 2.2.4 苹果细胞悬浮系
• 2.2.5 SSH 用材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 枝干和果实轮纹病自然发病情况调查及分级
• 2.3.2 接种菌液的制备
• 2.3.3 枝条接种方法
• 2.3.4 枝条接种调查方法
• 2.3.5 苹果枝条接种轮纹病菌病害分级标准
• 2.3.6 苹果细胞悬浮系的培养
• 2.3.7 轮纹病菌激发子的制备
• 2.3.8 苹果细胞悬浮系的处理
• 2.3.9 NO 产量测定
• 2.3.10 PAL 活性测定
• 2.3.11 植保素、丙二醛、过氧化氢含量测定
• 2.3.12 数据采集与统计分析方法
• 2.3.13 总RNA 的提取
• 2.3.14 RNA 纯化
• 2.3.15 mRNA 分离纯化
• 2.3.16 cDNA 第一链合成
• 2.3.17 cDNA 二链合成
• 2.3.18 cDNA 纯化
• 2.3.19 cDNA RsaI 酶切
• 2.3.20 接头连接
• 2.3.21 第一轮杂交
• 2.3.22 第二轮杂交
• 2.3.23 两轮差减PCR
• 2.3.24 两次差减PCR 扩增产物的纯化
• 2.3.25 差减文库的克隆
• 2.3.26 转化
• 2.3.27 PCR 鉴定差减文库的克隆插入片断大小
• 2.3.28 点膜及膜处理
• 2.3.29 探针标记及纯化
• 2.3.30 预杂交和杂交
• 2.3.31 洗膜
• 3 结果与分析
• 3.1 苹果种质资源轮纹病的抗性评价
• 3.1.1 苹果野生种质资源抗性评价
• 3.1.2 苹果砧木种质资源抗性评价
• 3.1.3 苹果品种种质资源抗性评价
• 3.2 苹果轮纹病性状的遗传
• 3.2.1 苹果果实轮纹病性状的遗传
• 3.2.2 苹果枝干轮纹病性状的遗传
• 3.3 NO 介导的苹果果实和细胞悬浮系对轮纹病的防御响应
• 3.3.1 四种激发子诱导富士苹果果实对轮纹病病菌侵染的防御响应
• 3.3.2 NO介导苹果细胞悬浮系对轮纹病侵染的防卫响应
• 3.3.3 茉莉酸甲酯诱导的苹果细胞悬浮系发生与轮纹病菌激发子相似的防卫响应
• 3.4 抑制性消减杂交分离苹果轮纹病菌侵染诱导的抗病相关基因
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 发表论文
• 致谢