一株鞘氨醇单胞菌对多环芳烃的降解特性及菲降解途径研究

论文摘要

多环芳烃是一类在环境中有广泛分布的有机化学污染物,具有“三致”性（致畸、致突变、致癌）,通过食物链的传递会对生态环境和人体健康造成极大危害。微生物修复是消除PAHs污染的有效方式。研究降解菌的遗传控制、探索代谢途径、解析相关酶系和功能基因,从而构建基因工程菌株用于污染环境的生物修复是当前研究的热点。本论文对一株筛选自厦门博坦油码头表层海水的高效菲降解细菌Sphingomonas sp.H的生理生化特征、对PAHs的降解特性、降解条件、降解关键酶基因、差异表达蛋白质组等方面进行了较为系统的研究,获得的主要结果如下:1.降解能力测定显示,鞘氨醇单胞菌H能以菲和荧蒽作为唯一碳源生长,并能利用PAHs代谢途径中的中间产物,包括2—萘酚、水杨酸、邻苯二酚、苯酚和原儿茶酸。利用均匀设计对鞘氨醇单胞菌H降解菲的条件进行优化,DPS软件数据处理系统分析表明在接种量OD600为0.5,菲起始浓度为498.467 mg L-1,降解时间为47.099 h时,降解速率最大为8.104 mgL(-1(h-1,降解率可达76.6%。2.通过引物设计的方法,从鞘氨醇单胞菌H中扩增得到全长的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因（C230）,从分子生物学角度证明了PAHs降解过程中的重要酶系邻苯二酚-2,3-双加氧酶（C230）在鞘氨醇单胞菌H中的存在。对C230基因构建了重组表达载体,成功在表达宿主大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中进行表达,基因在宿主中以溶解蛋白和包涵体形式同时存在。可以进一步推断鞘氨醇单胞菌H降解菲的基本途径是在C230的作用下经由水杨酸途径问位裂解（meta-cleavage）苯环,生成2-羟基粘康酸半醛（2-HMS）,从而降解菲。3.采用2-DE（双向凝胶电泳）结合LC-MS/MS（串联质谱）,研究鞘氨醇单胞菌H在菲诱导与无菲诱导（对照）状况下的蛋白质表达,对差异蛋白的生物质谱结果进行分析,得到多个代谢途径中的关键酶（加氧酶、脱氢酶、醛缩酶等）,结合鞘氨醇单胞菌H的降解特性与降解基因的研究结果,最终推导出鞘氨醇单胞菌H降解菲较为完整的代谢途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 多环芳烃的来源与危害
• 1.1 多环芳烃的来源
• 1.2 多环芳烃的危害
• 2 多环芳烃污染环境的生物修复
• 2.1 降解PAHs的微生物
• 2.2 影响微生物修复PAHs的因子
• 3 菲的微生物降解及相关的降解途径
• 3.1 降解菲的微生物
• 3.2 细菌对菲的降解途径研究
• 4 多环芳烃降解途径的研究方法
• 4.1 化学分析方法
• 4.2 基因组学研究方法
• 4.3 蛋白质组学方法在多环芳烃生物降解代谢途径研究中的应用
• 5 本论文的研究内容及意义
• 第二章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 降解菌株
• 1.2 菌体和质粒
• 1.3 主要试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 PCR引物
• 1.6 主要培养基
• 1.7 溶液配制
• 2 基本方法
• 2.1 鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化
• 2.2 降解菌基因文库的构建
• 2.3 降解关键酶基因的克隆与表达
• 2.4 鞘氨醇单胞菌H的蛋白质组学实验
• 第三章 结果与分析
• 第一节 鞘氨醇单胞菌H对PAHs的降解特性及降解条件优化
• 1 鞘氨醇单胞菌H的分子鉴定
• 2 鞘氨醇单胞菌H的生理生化特性
• 3 鞘氨醇单胞菌H对不同PAHs的降解
• 4 降解菌对菲降解条件的优化
• 第二节 鞘氨醇单胞菌H基因文库的构建及降解关键酶基因的克隆与表达
• 1 基因组（3-10 kb）文库构建
• 2 鞘氨醇单胞菌H降解关键酶基因的克隆与表达
• 第三节 运用双向电泳技术追踪鞘氨醇单胞菌H降解PAHs过程中的差异表达蛋白
• 1 降解过程中菌体蛋白提取方法的优化
• 2 菲诱导下鞘氨醇单胞菌H的蛋白表达
• 3 LC-MS/MS分析
• 4 与菲代谢相关的蛋白质鉴定
• 5 鞘氨醇单胞菌H降解菲的代谢途径推测
• 第四章 讨论
• 1 均匀设计在降解菌对多环芳烃降解条件优化上的应用
• 2 降解关键酶基因的克隆、表达与同源性分析
• 3 细菌全蛋白提取方法
• 4 鞘氨醇单胞菌H降解菲的降解途径推测
• 4.1 鞘氨醇单胞菌H对PAHs降解过程中的中间代谢产物的利用
• 4.2 PAHs降解关键酶基因的克隆与表达
• 4.3 差异表达蛋白组学的研究
• 第五章 结论与展望
• 1 结论
• 2 本论文创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 附录
• 附录一 参与的科研课题、发表和待发表的学术论文
• 附录二 载体图谱
• 附录三 缩略语对照表
• 致谢