新基因HA117全长cDNA克隆及其耐药功能的实验研究

论文摘要

目的应用组织芯片结合原位杂交的方法筛选出HA117基因组织表达谱。然后以组织表达谱筛选出的高表达HA117基因的肾脏组织为模板,通过RACE的方法克隆基因全长cDNA,进一步应用重组腺病毒介导的方法获得高表达HA117基因的K562、Jurkat细胞,初步研究HA117基因对K562、Jurkat细胞的多药耐药（MDR）功能。方法1组织表达谱筛选,选取石蜡包埋的31例常见肿瘤组织标本制和17例癌旁正常组织制作组织芯片,应用mRNA原位杂交技术检测HA117 mRNA在组织芯片各种组织中的表达情况;2组织表达谱结果提示肾脏组织高表达HA117基因,收集并提取肾脏组织总mRNA,首先应用RT-PCR方法验证HA117基因在肾脏组织表达情况;然后在高表达HA117基因肾脏组织中,根据已获得的已知HA117基因序列为模板设计特异引物,通过RACE技术克隆HA117基因全长cDNA序列;3构建携带新基因HA117全长cDNA序列的重组腺病毒,酶切质粒载体pAdTrack-CMV和目的基因HA117后,用T4DNA连接酶将载体和目的基因定向克隆连接,然后筛选和鉴定含目的基因HA117的重组质粒pAdTrack- HA117。将筛选正确的质粒pAdTrack- HA117导入已制备的腺病毒同源骨架质粒BJ-Adeasy中,产生腺病毒质粒Adeasy- HA117,进一步酶切鉴定得到的重组腺病毒质粒Adeasy- HA117。脂质体介导的方法将Adeasy- HA117转染入产病毒包装细胞HEK 293,通过乒乓感染,收获高滴度Ad5- HA117重组腺病毒;并用RT-PCR方法验证,HA117基因在重组腺并毒Ad5- HA117感染的HEK293细胞的表达情况;4重组腺病毒Ad5- HA117体外感染K562、Jurkat细胞,将重组腺病毒Ad5- HA117体外感染K562、Jurkat细胞,应用流式细胞术及RT-PCR方法检测感染后的K562细胞HA117表达情况;5检测感染重组腺病毒Ad5- HA117使HA117基因高表达后白血病细胞耐药性改变:实验分四组:K562细胞组,K562/ Ad5- HA117细胞组, K562/ Ad5-GFP细胞组, K562/ Ad5-mdr1细胞组,Jurkat细胞分组同K562。通过对细胞活性、细胞形态学及MTT法抗癌药物敏感实验,柔红霉素排泄实验等检测HA117基因高表达前后细胞形态及耐药性的变化,初步研究HA117基因的耐药功能及耐药机制。结果1新基因HA117 mRNA在人体癌旁正常组织和良性肿瘤、恶性肿瘤组织中均有表达,恶性肿瘤组织中表达阳性率高于良性肿瘤及癌旁正常组织中表达阳性率（P>0.5）。在鳞癌和腺癌中的阳性表达率分别是16.67%和61.54%,腺癌中的表达高于鳞癌（P<0.05）。有转移的癌组织中HA117 mRNA的表达率高达70%,明显高于非转移型肿瘤组织的20%（P<0.05） ;2首先采用RT-PCR方法验证了HA117基因在肾脏组织中高表达。HA117基因的3′RACE PCR产物大小在400bp左右, 5′以RACE PCR产物大小在950bp左右,将HA117基因3′RACE序列、5’RACE扩增序列与己知的HA117基因序列拼接后,得到1110 bp的全长cDNA序列;3经酶切鉴定成功构建腺病毒重组质粒Ad5- HA117,重组腺病毒Ad5- HA117成功转染包装细胞,在细胞内得到良好的表达,并在包装细胞中迅速扩增,获得高滴度的重组腺病毒。收获的病毒感染液滴度达1.5×1011pfu/ml;RT-PCR方法证实外源性HA117基因在感染HEK293细胞基因组中功能性表达;4重组腺病毒Ad5-HA117成功将外源性HA117基因导入K562、Jurkat细胞,转染48小时后发现随着感染复数的增加,病毒对K562、Jurkat细胞的感染率也增加, MOI值为100时细胞的存活率和感染率均较好,转染率分别可以达到39.72%、17.10%;RT-PCR方法证实外源性HA117基因在转染K562、Jurkat细胞基因组中功能性表达;5转染HA117基因的K562、Jurkat细胞对VCR、AD5M、Vp-16、DNR、MMC、CTX药物的耐药性均比低表达HA117基因未转染的k562、Jurkat细胞增高,分别增高27倍（P<0.05或0.01）,转染空载体组细胞耐药性跟未转染组的k562、Jurkat细胞相比无显著差异（P>0.05）;感染Ad5-HA117组细胞与感染Ad5-mdr1组相比,耐药性无显著差异（P>0.05）。转染HA117基因的使其高表达后的K562、Jurkat细胞,与转染了MDR1基因的细胞组柔红霉素排除实验结果显示,感染Ad5-HA117组细胞未见有明显的药物外排泵功能。结论1初步证实HA117基因,在人体癌旁正常组织和良性肿瘤、恶性肿瘤组织中均有表达,恶性肿瘤组织中表达阳性率高于良性肿瘤及癌旁正常组织中表达阳性率。HA117表达阳性率可能与恶性肿瘤的组织学类型及是否为转移瘤有关;2肾脏组织中高表达HA117基因,采用RACE法从肾脏组织中成功克隆得到了HA117基因全长cDNA序列,为全长1110bp;3应用分子生物学方法构建了HA117重组腺病毒Ad5- HA117。通过荧光显微镜证实,重组腺病毒Ad5- HA117成功转染包装细胞,在细胞内得到良好的表达,获得高滴度的重组腺病毒。证实外源性HA117基因在感染的HEK293细胞有效表达;4通过腺病毒载体可在体外将外源性HA117基因有效的转K562、Jurkat细胞中,转染的HA117基因能在靶细胞中表达;5初步证实HA117基因具有多药耐药功能;其多药耐药功能可能不是遵循mdr1经典的药物外排泵机制。

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正题 新基因HA117 全长CDNA 克隆及其耐药功能的实验研究
• 前言
• 第一部分 组织芯片分析新基因HA117 在正常组织及常见肿瘤组织的表达谱.
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第二部分 新基因HA117 全长CDNA 克隆与鉴定
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第三部分 新基因HA117 重组腺病毒的构建及鉴定
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 第四部分 新基因HA117 对白血病细胞株K562、JURKAT 耐药功能研究
• 前言
• 1. 材料与方法
• 2. 结果
• 3. 讨论
• 4. 结论
• 全文小结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文