重组人心肌营养素在大肠杆菌中的表达及其生物活性的鉴定

论文摘要

心肌营养素是一种多效性细胞因子具有广泛的生物学活性。为鉴定人心肌营养素具有促进受损大鼠心肌细胞存活及诱导肝癌细胞增殖的生物学活性，本实验构了建PQE-huCT-1表达载体，在大肠杆菌中表达重组人心肌营养素（rhCT-1）；利用含有还原型及氧化型谷胱甘肽的复性体系，恢复变性蛋白的天然构象；通过MTT法鉴定rhCT-1的体内生物学活性，构建异丙肾上腺素心肌损伤模型鉴定其体内生物学活性。PQE-huCT-1在M15菌中得到高效表达，但95％的目的蛋白以包涵体形式存在；通过变性、复性及Ni+-NTA纯化，得到纯度为95％的可溶性重组蛋白。利用无血清的培养基培养新生大鼠心肌细胞，造成缺血损伤；利用低浓度阿霉素损伤大鼠心肌细胞，构建阿霉素损伤模型；通过加入rhCT-1治疗，发现rhCT-1具有明显的促进受损心肌细胞存活的作用；心肌细胞琥珀酸脱氢酶（SDH）活性随rhCT-1浓度的升高而增强，且呈显著的剂量依赖性关系；通过测定预防组和治疗组心肌细胞SDH和乳酸脱氢酶（LDH）活性，发现预防组较治疗组在促进细胞线粒体产生SDH和降低培养液上清LDH活性方面效果更加显著，说明rhCT-1可能是在心肌细胞损伤早期通过抑制细胞凋亡而达到心肌保护作用的。利用异丙肾上腺素注射大鼠，造成大鼠心肌缺血损伤；注射rhCT-1后，发现治疗组心肌损伤程度明显减轻，心肌结构基本正常，血清中谷草转氨酶（AST），肌酸激酶（CK），乳酸脱氢酶—1（LDH-1）三项酶活指标均显著低于损伤组。利用MTT实验对rhCT-1促进肝癌细胞增殖的生物学活性进行初步研究，发现rhCT-1可以显著促进Bel-7402型肝癌细胞琥珀酸脱氢酶的活性，刺激细胞增殖。本实验通过复性获得了可溶性rhCT-1，其在体内体外均具有显著的促进受损心肌细胞存活的生物学活性，并且在促进肝癌细胞增殖方面也有显著效果，为今后的科研及应用研究奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 CT－1基因的分布及结构
• 1.2 CT－1基因的表达
• 1.3 CT－1的受体及信号传导途径
• 1.4 CT-1与心血管疾病的关系
• 1.4.1 CT-1对心脏及心肌细胞的保护作用
• 1.4.2 CT-1的诱导促心肌肥大作用
• 1.4.3 CT-1对心肌成纤维细胞胶原蛋白合成作用
• 1.4.4 CT－1与心力衰竭
• 1.4.5 CT－1与缺血性心脏病
• 1.4.6 CT－1对血流动力学的作用
• 1.4.7 CT－1与其他心血管疾病
• 1.5 CT-1对肝脏及肝实质细胞的保护作用
• 1.6 CT-1对神经系统的影响
• 1.7 本文立题背景及研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 菌种及质粒
• 2.1.3 主要试剂及酶类
• 2.1.4 常规培养基、缓冲液及储备液
• 2.1.5 细胞活性实验及动物实验试剂
• 2.1.6 实验动物及细胞株
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的基因的克隆及重组质粒的构建
• 2.2.1.1 引物设计
• 2.2.1.2 PCR反应体系
• 2.2.1.3 PCR产物的纯化
• 2.2.1.4 PCR产物及PQE-40 BamHI和HindIII的双酶切
• 2.2.1.5 目的基因及载体酶切产物的电泳分离及纯化
• 2.2.1.6 目的基因与载体的连接
• 2.2.1.7 制备感受态细菌及连接产物的转化
• 2.2.1.8 质粒提取
• 2.2.1.9 重组质粒（PQE-rhCT-1）的酶切鉴定
• 2.2.2 重组质粒的表达
• 2.2.3 不同表达时间对蛋白表达量的影响
• 2.2.4 包涵体的洗涤
• 2.2.5 包涵体的变性及目的蛋白的纯化
• 2.2.6 复性缓冲液的选折
• 2.2.6.1 不同离子强度对复性的影响
• 2.2.6.2 不同pH对复性的影响
• 2.2.6.3 不同脲的终浓度对复性的影响
• 2.2.6.4 不同添加剂对复性的影响
• 2.2.6.5 不同蛋白终浓度对复性的影响
• 2.2.7 变性蛋白的复性
• 2.2.8 等电点测定
• 2.2.9 rhCT-1促进受损大鼠心肌细胞存活的生物活性鉴定
• 2.2.10 rhCT-1预防组、治疗组对体外培养受损大鼠心肌细胞的琥珀酸脱氢酶及乳酸脱氢酶活性影响的比较
• 2.2.11 rhCT-1对异丙肾上腺素造成大鼠心肌缺血损伤的保护作用
• 2.2.12 rhCT-1促进Bel-7402肝癌细胞琥珀酸脱氢酶活性的生物活性鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 表达载体PQE-huCT-1的构建
• 15菌中的表达及可溶性分析'>3.2 PQE-huCT-1在M₁₅菌中的表达及可溶性分析
• 3.3 不同表达时间对目的蛋白表达量的影响
• 3.4 包涵体的洗涤
• 3.5 目的蛋白的纯化
• 3.6 不同因素对蛋白复性的影响
• 3.7 等电点的测定
• 3.8 rhCT-1促进受损大鼠心肌细胞存活生物活性的鉴定
• 3.9 rhCT-1预防组、治疗组对体外培养受损大鼠心肌细胞的琥珀酸脱氢酶及乳酸脱氢酶活性影响的比较
• 3.10 rhCT-1对异丙肾上腺素损伤大鼠心肌细胞的修复作用
• 3.11 rhCT-1促进Bel-7402细胞琥珀酸脱氢酶活性作用
• 第四章 讨论
• 15[pREP4]介绍'>4.1 质粒PQE-40和宿主M₁₅[pREP4]介绍
• 4.2 融合蛋白基因的构建
• 4.3 融合蛋白基因的表达
• 4.4 融合蛋白的纯化及复性
• 4.5 rhCT-1促进受损心肌细胞存活的生物学活性
• 4.6 rhCT-1对异丙肾上腺素损伤大鼠心肌细胞的修复
• 4.7 rhCT-1刺激Bel-7402肝癌细胞的增殖
• 第五章 结论
• 附图
• 参考文献
• 参与的工作
• 致谢