深海细菌Shewanella piezotolerans WP3极端环境适应性机理的研究——脂肪酸系统与深海噬菌体SW1在环境适应中的作用和调控

论文摘要

深海是一个特殊的生态环境,这里有着永久的低温、高压和黑暗。生活在这些环境下的极端微生物必然有特殊的生理代谢途径来适应这种极端环境。对深海微生物的研究不仅有助于了解生命的起源,而且可以了解各种极端微生物的生活特性,有助于对深海微生物资源的开发利用。极端条件下的生命和生态现象研究将可能揭示生命适应逆境、演化自身的能力,为人类健康开辟新的途径。本文所研究的深海细菌分离自西太平洋1914米的深海沉积物中。菌种鉴定为Shewanella piezotolerans WP3,它既是耐压菌,又是低温菌,现在已经完成其全基因组序列的测定,是研究极端微生物适应极端环境的理想材料。本文用WP3作为实验材料,通过模拟深海低温高压极端生存条件,并结合各种分子生物学手段,对脂肪酸系统在深海极端环境中的作用,及其表达和调控进行了全面地分析,使我们对极端微生物的极端环境适应性机理有了更为深入的了解。此外,我们成功的从WP3中分离出了世界上第一株深海丝状噬菌体SW1,这也是由希瓦氏细菌中分离出来的第一株丝状噬菌体,在对它的性质进行研究时,我们发现了它与深海低温环境相关的一系列低温性质,这为研究深海噬菌体在深海环境中的作用奠定了一定的基础。希瓦氏细菌广泛的分布在各种环境中,它们能够合成多种低熔点脂肪酸,是研究脂肪酸系统与细胞环境适应性关系的理想材料。通过对15株已完成全基因组测序的希瓦氏细菌的基因组序列进行比较后,我们构建出了希瓦氏细菌的Ⅱ型脂肪酸合成途径和EPA合成途径。此外还发现所有的希瓦氏细菌都包含了完整的EPA合成基因簇,但是只有其中少数的希瓦氏细菌被报道能够合成EPA。我们选用Shewanella piezotolerans WP3为模型,对脂肪酸系统在希瓦氏细菌中的作用和调控进行了更为全面和深入的研究。通过GC-MS对WP3脂肪酸成分进行的分析显示,WP3能够合成支链脂肪酸,单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸EPA三种低熔点脂肪酸。随着培养温度的降低和压力的升高,其中的支链脂肪酸和多不饱和脂肪酸含量都出现了明显增加。与其它绝大多数细菌的情况不一样,单不饱和脂肪酸在低温高压环境中的含量不但没有增加,反而出现了一定程度上的下降。随后通过一系列的基因敲除实验,以及浅蓝菌素（Cerulenin）抑制单不饱和脂肪酸合成的实验,我们证明多不饱和脂肪酸EPA的缺失能够抑制WP3在低温和高压下的生长,支链脂肪酸的减少也会降低WP3在低温下的生长能力,但是单不饱和脂肪酸含量的大量降低却对WP3的低温高压生长并没有造成影响,这证明了支链脂肪酸和多不饱和脂肪酸是WP3低温高压生长所必需的,而单不饱和脂肪酸是非必需的。利用已构建好的WP3全基因组基因芯片进行芯片杂交实验,用以分析WP3在不同温度（4℃和20℃）和压力（0.1Mpa和20Mpa）条件下基因的表达差异变化。发现在低温条件下,支链氨基酸转运系统的所有基因都呈现出上调趋势,并用实时荧光定量PCR方法对芯片结果进行了验证。随后,利用DNA同源重组的方法对支链氨基酸转运系统中唯一的底物结合蛋白（swp3487）进行了缺失突变,与WP3野生菌株支链脂肪酸含量在低温和高压条件下大量增加不同,所得到的突变子WP3△LIV-I在不同温度和压力下支链脂肪酸含量变化很小,显示了支链氨基酸转运系统对WP3支链脂肪酸的含量具有重要的调节能力。随后,通过在野生菌株和突变菌株的培养基中添加13C标记的外源亮氨酸,我们进一步证明了低温下支链脂肪酸含量的增加主要是由于支链氨基酸转运系统在低温下为支链脂肪酸的合成转运了更多的外源底物所致。通过对WP3全基因组序列进行分析,我们发现其中可能包含了一株具有活性的丝状噬菌体,并将其命名为SW1。SW1基因组DNA长7718bp,包含了9个开放性阅读框（ORF）,其中绝大部分ORF都与已知的一些丝状噬菌体基因显示出了最大的同源性。通过双向电泳（2D-PAGE）,我们发现噬菌体中的单链DNA结合蛋白在4℃下呈现出高表达。考虑到单链DNA结合蛋白决定了噬菌体组装的起始,因此我们判断大量成熟的SW1噬菌体在4℃被诱导合成,根据这一线索我们成功地在4℃条件下分离出了具有活性的SW1噬菌体颗粒。随后,利用希瓦氏菌属四个菌株（Shewanella oneidensis,Shewanella marinaci,Shewanellaviolacea和Shewanella sp.WP2）加上大肠杆菌共5株菌来作为测试菌,检测SW1噬菌体的宿主范围。最后发现,只有与WP3从同一地点分离出来的WP2能够被SW1侵染并形成噬菌斑。而且,只有当培养温度低于或等于15℃时才能观察到噬菌斑的形成。随后的实验证明,当温度高于15℃时噬菌体能够正常侵染WP2,但是只有当温度下降到15℃或以下时,噬菌体才在WP2中大量合成并最终导致噬菌斑的产生,这暗示了噬菌体可能存在低温诱导特性。对SW1的热稳定性分析发现,70℃处理10分钟就能让SW1噬菌体完全失活,比一般丝状噬菌体的最高耐受温度足足低了10℃,这也再一次显示了SW1的低温特性。利用实时荧光定量PCR方法对噬菌体主要基因在4℃和20℃下的转录水平进行了分析,发现在4℃下这些主要基因,包括噬菌体自身抑制子基因orf116都出现了3-12倍不同程度的高表达。随后的噬菌体滴度实验进一步发现,只有当培养温度低于或等于15℃时才能分离出具有活性的SW1噬菌体颗粒,并且随着温度的降低噬菌体的滴度不断增加。这进一步证明了低温能够诱导SW1噬菌体的合成和释放。在对SW1噬菌体低温诱导机制进行的初步研究中发现,利用紫外线（UV）和丝裂霉素C这些能够引起细胞SOS反应的因素处理WP3,同样能够诱导SW1的大量表达。这说明与其它噬菌体一样,SW1的合成也受到SOS途径的调控。但是,与低温诱导现象不同的是噬菌体的自身抑制子基因orf116在受到紫外线和丝裂霉素C处理后的表达量并没有出现增高,这说明低温诱导机制与SOS诱导机制并不完全一样,很可能在WP3中还存在着一条有别于SOS途径的噬菌体诱导途径。

论文目录

• 缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 深海微生物研究的概况
• 2 深海微生物极端环境适应性机理研究进展
• 2.1 深海微生物低温适应性机理的研究
• 2.2 深海微生物高压适应性机理的研究
• 3 脂肪酸系统与环境关系的研究
• 4 丝状噬菌体研究概况
• 4.1 丝状噬菌体的基因结构和功能
• 4.2 丝状噬菌体的生活史
• 4.2.1 丝状噬菌体的感染过程
• 4.2.2 丝状噬菌体DNA的复制
• 4.2.3 丝状噬菌体基因的转录和翻译
• 4.2.4 丝状噬菌体的装配
• 4.3 丝状噬菌体诱导机制的研究
• 5 本论文的研究目的和意义
• 第二章 深海细菌Shewanella piezotolerans WP3脂肪酸系统在不同温度和压力下的作用和调控
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株与质粒
• 1.1.2 引物
• 1.1.3 主要仪器
• 1.1.4 工具软件
• 1.1.5 主要试剂
• 1.1.6 工具酶
• 1.1.7 试剂盒
• 1.1.8 常用溶液、培养基的配制
• 1.2 方法
• 1.2.1 不同条件下的细菌培养
• 1.2.2 细菌总DNA的提取
• 1.2.3 WP3总RNA的提取
• 1.2.4 基因组DNA的去除及RNA的纯化
• 1.2.5 DNA乙醇沉淀
• 1.2.6 PCR反应
• 1.2.7 菌落PCR
• 1.2.8 琼脂糖凝胶上DNA片段的回收
• 1.2.9 PCR产物的回收
• 1.2.10 核酸内切酶酶切反应
• 1.2.11 质粒去磷酸化处理
• 1.2.12 连接反应
• 1.2.13 化学感受态细胞的制备
• 1.2.14 质粒的化学转化
• 1.2.15 质粒提取
• 1.2.16 同源性比对
• 1.2.17 反转录PCR（RT—PCR）
• 1.2.18 脂肪酸样品的制备与检测
• 1.2.19 缺失突变载体和突变菌株的构建（双亲杂交）
• 2 结果与分析
• 2.1 希瓦氏菌中与脂肪酸合成相关的基因和途径
• 2.2 WP3脂肪酸在不同温度和压力下的变化
• 2.3 EPA,而不是单不饱和脂肪酸是WP3低温高压生长所必需的
• 2.3.1 EPA缺失突变菌株的构建及其脂肪酸成分的分析
• 2.3.2 EPA对WP3低温高压生长的影响
• 2.3.3 浅蓝菌素（Cerulenin）处理后WP3脂肪酸成分的变化
• 2.3.4 单不饱和脂肪酸含量的降低对WP3低温高压生长的影响
• 2.4 EPA和单不饱和脂肪酸合成的调控
• 2.4.1 脂肪酸相关基因转录水平的分析
• 2.4.2 EPA合成的调控
• 2.4.2.1 Fis型转录调控因子（swp3548）缺失突变株的构建及其脂肪酸成分的分析
• 2.4.2.2 Fis突变菌株EPA基因转录水平的分析
• 2.4.3 单不饱和脂肪酸合成的调控
• 2.4.3.1 需氧途径在WP3单不饱和脂肪酸合成中的作用
• 2.4.3.2 厌氧途径在WP3单不饱和脂肪酸合成中的作用
• 2.5 支链脂肪酸的作用和调控
• 2.5.1 支链氨基酸转运系统（LIV-I）结构和功能分析
• 2.5.2 LIV-I突变菌株的构建及其脂肪酸成分的分析
• 2.5.3 支链脂肪酸含量的降低对WP3生长的影响
• 2.5.4 同位素示踪实验对LIV-I调控作用的验证
• 2.6 LIV-I系统在希瓦氏细菌中的进化
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 深海噬菌体SW1的分离鉴定及其低温特性的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 引物序列
• 1.1.2 探针序列
• 1.2 方法
• 1.2.1 丝状噬菌体颗粒的提取
• 1.2.2 质粒形式（RF）丝状噬菌体DNA的提取
• 1.2.3 单链形式（SS）丝状噬菌体DNA的提取
• 1.2.4 噬菌体侵染实验
• 1.2.5 噬菌体热稳定性的检测
• 1.2.6 噬菌体宿主范围的检测
• 1.2.7 噬菌体颗粒的透射电镜观察
• 1.2.8 Southern杂交
• 1.2.9 双向电泳
• 2 结果与分析
• 2.1 SW1丝状噬菌体基因组结构分析
• 2.2 SW1丝状噬菌体颗粒的分离及形态的观察
• 2.3 SW1丝状噬菌体基本性质的测定
• 2.4 SW1丝状噬菌体宿主范围的检测
• 2.5 SW1丝状噬菌体低温侵染特性及热稳定性的研究
• 2.6 温度对SW1丝状噬菌体表达调控的研究
• 2.7 SW1丝状噬菌体低温诱导机制的初步研究
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢