丹参毛状根培养体系建立及诱导子的作用研究

论文摘要

丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）是我国传统的常用中草药之一。近几年,围绕丹参进行的研究很多,而丹参毛状根又是其中的研究热点,这与其自身特点有很大关系。本文以发根农杆菌ATCC 15834和丹参叶片为材料,经过侵染、共培养、除菌、扩大培养等过程得到丹参毛状根培养体系。以此为基础,测定丹参毛状根生长动态及丹参酮合成动态变化,之后探讨了6种诱导子——酵母提取物（Yeast extract）、黑曲霉（Aspergillus niger）超声波、Zn2+、Ca2+和Mg2+对丹参毛状根生长、3种丹参酮（丹参酮Ⅰ、二氢丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA）合成积累以及保护酶系（SOD、POD、CAT）的影响。为提高丹参毛状根悬浮培养生长率及丹参酮合成提供依据。1.利用发根农杆菌ATCC 15834侵染丹参叶片从而得到丹参毛状根,实验中确定了侵染时间（30min）、共培养时间（2-3d）、除菌方法（40℃高温除菌）以及培养用培养基（MS-N）。丹参毛状根经扫描电镜观察发现其表面存在很多生长点,且生长后均呈中空囊状,毛状根由许多中空管构成,此种形态利于其在液体培养基中生长吸收水分和养分。2.经实验测定,丹参毛状根悬浮培养具有以下基本特性:（1）丹参毛状根生长率与培养基中的糖含量存在线性关系且拟合性良好,呈反比;（2）毛状根生长存在延迟期（0-3d）,快速生长期（3-21d）,及生长平缓期（21-24d）;（3）丹参酮合成量迅速增加期出现在培养的第9天之后,并在第15天到达第二次迅速增长期,于21天时增长速度开始减缓;（4）鉴于毛状根生长和丹参酮合成量,诱导子加入时间应为培养的第18天。3.两种生物诱导子（酵母提取物和黑曲霉诱导子）和三种离子（Ca2+、Mg2+和Zn2+）在不同处理浓度时均促进丹参毛状根的生长,而超声波处理会抑制毛状根的生长。6种诱导子对毛状根中SOD活性均有抑制作用;两种生物诱导子使毛状根POD活性升高,而使CAT活性降低;Mg2+和Ca2+均抑制POD和CAT的活性,而Zn2+则相反;超声波处理后POD和CAT活性变化与生物诱导子处理相反。比较发现,毛状根生长率较高时,3种保护酶的活性也相对较高。4.不同诱导子加入后对丹参毛状根的生长及丹参酮合成动态影响结果如下:（1）两种生物诱导子随诱导时间的延长对丹参酮合成有明显的促进作用, Zn2+、Mg2+和Ca2+随诱导时间的延长对丹参酮合成的促进作用并不明显,而超声波处理随诱导时间的延长对丹参酮合成有明显的抑制作用。（2）诱导子处理后,3种保护酶的活性均先出现增高趋势,随着培养时间的延长,3种酶的活性也随之降低而趋于稳定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 丹参
• 1.1.1 丹参的主要化学成分
• 1.1.2 丹参的药理作用
• 1.1.3 丹参的组织培养
• 1.2 毛状根
• 1.2.1 毛状根的诱导
• 1.2.2 毛状根的特点
• 1.2.3 毛状根中次生代谢产物
• 1.2.4 对毛状根次生代谢产物形成产生影响的因素
• 1.2.5 毛状根培养技术的应用前景
• 1.3 丹参毛状根的研究进展
• 1.4 诱导子
• 1.4.1 诱导子的种类
• 1.4.2 诱导子的作用机制
• 1.4.3 诱导子作用的特点
• 1.5 本研究的目的和意义
• 第二章 丹参毛状根培养体系的建立
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 毛状根培养体系的建立
• 2.3.2 毛状根显微结构研究
• 2.4 结论与讨论
• 第三章 丹参毛状根悬浮培养生长特性的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 丹参毛状根的培养
• 3.2.2 毛状根湿重测定方法
• 3.2.3 可溶性糖含量测定方法
• 3.2.4 保护酶活性测定方法
• 3.2.5 丹参毛状根丹参酮含量测定方法
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 丹参毛状根悬浮培养生长曲线
• 3.3.2 丹参毛状根悬浮培养时丹参酮积累研究
• 3.3.3 丹参毛状根悬浮培养3 种保护酶活性变化
• 3.3.4 丹参毛状根悬浮培养培养液糖含量变化
• 3.3.5 毛状根生长率与糖消耗之间的计量关系
• 3.4 结论与讨论
• 第四章 诱导子对丹参毛状根生长及保护酶活性的影响
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 丹参毛状根的培养
• 4.2.2 诱导子的制备
• 4.2.2.1 生物诱导子制备
• 4.2.2.3 非生物诱导子制备
• 4.2.3 毛状根湿重测定方法
• 4.2.4 保护酶活性测定
• 4.2.5 诱导方案
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 诱导子对丹参毛状根生长率的影响
• 4.3.2 诱导子对丹参毛状根保护酶活性的影响
• 4.4 结论与讨论
• 第五章 诱导子对丹参毛状根培养的动态影响
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 丹参毛状根的培养
• 5.2.2 诱导子的制备
• 5.2.3 毛状根湿重测定方法
• 5.2.4 保护酶活性测定
• 5.2.5 丹参酮含量测定
• 5.2.6 诱导方案
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 诱导子对丹参毛状根丹参酮合成的影响
• 5.3.2 诱导子对丹参毛状根保护酶活性的影响
• 5.4 结论与讨论
• 第六章结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介