亚洲璃眼蜱功能基因的克隆、表达和免疫效果分析

论文摘要

目的意义:蜱是动物体表的一类常见吸血节肢动物,能够传播多种疾病,如原虫病、细菌病、病毒病等,其所带来的危害不仅给畜牧业生产和人类健康构成了极大挑战,也造成了巨大的经济损失,故此蜱的控制已经成为广大研究者共同关注的课题。我国目前有100多个蜱种,亚洲璃眼蜱主要分布于我国西北部的荒漠地区,主要传播新疆出血热。 目前对蜱的控制主要使用化学杀虫剂。然而,随着蜱抗药性以及畜产品的药物残留等问题的出现,寻找新的抗蜱方法就显得尤为重要。相对于化学杀虫剂来说,免疫预防被认为是一种最有前途的控制蜱的方法,而大量具有免疫作用的功能基因的发现是这种方法实现的前提。故此,本研究以从本实验室建立的亚洲璃眼蜱雌蜱未吸血和半饱（吸血5天）状态的唾液腺基因表达差异建立的消减文库中筛选出的两个新基因EST片段为对象（根据基因大小分别命名为AP27、AP18）,开展这两个基因的全长克隆、体外表达及免疫工作以分析其功能,为蜱和蜱病的控制作一些探索。 方法及结果:首先运用生物软件分析两个EST片段（据测序号分别命名为1-6和B12）的结构,分析出其中一个EST片段（1-6）为一完整基因结构,该基因开放性阅读框含510个碱基,共编码170个氨基酸,预测分子量为18.36Kda,故将其正式命名为AP18;另一基因片段（命名为B12）具有典型的基因3′端特征,而5′端缺失,故根据已有序列设计三条基因特异性引物:GSPI=5′—TGTACTGGAGCATGCAC—3′,GSP2=5′—GAGCACACCGGGTCAGGTCCTTG—3′,GSP3=CTTCATCTCGTTGGGTGATC—3′,用于5′-RACE扩增。PCR产物经纯化、连接入pGEM-T质粒载体、转化大肠杆菌DH5α和测序。根据测序结果,设计基因特异性引物用于扩增全长基因:上游=5′-CAATCCAGTGTCGAAACATGCGC-3′,下游=5′-ACGCTACTTCTGCGAACGCC-3′,PCR产物经纯化、连接、转化和测序分析,结果得到B12全长基因序列,该基因开放阅读框内含728个碱基,共编码243个氨基酸,分子量预测为27.28Kda,故亦将其正式定名为AP27。利用软件和生物信息学网站进行两个基因功能的初步预测,结果显示两个基因均为新基因,其中AP18可能为蜱体内的一凝血肽;AP27可能与基因的转录作用相关。 其次,运用RT-PCR方法分析AP18、AP27在亚洲璃眼蜱中的分布情况,分别提取亚洲璃眼蜱雌蜱的未吸血成蜱的唾液腺和半饱血成蜱不同部位包括壳、唾液腺、肠的总RNA,取相同量的总RNA进行RT-PCR分析,结果二者在蜱的壳、肠、和吸血时的唾液腺中均有表达,而在未吸血蜱的唾液腺中不表达;且在壳中的表达丰度相较略低。 再分别将两个基因重组入PET28a、PET32a、PGEX-4T系统进行体外原核表达,结果在PET32a中成功表达出AP18基因蛋白,但AP27基因由于某些未知原因,在三个系统中均未能成功表达。故重点分析AP18基因重组蛋白的功能:将AP18/PET32a重组蛋白纯化后作为抗原三次免疫小鼠,ELISA实验测定抗体效价变化,选择出其中

论文目录

• 综述：蜱功能基因研究进展
• 引言
• 第一章：亚洲璃眼蜱AP27基因的克隆和序列分析
• 1.材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌种
• 1.3 仪器设备
• 1.4 主要试剂的配制
• 2.方法
• 2.1 亚洲璃眼蜱的实验室饲养
• 2.2 亚洲璃眼蜱唾液腺总RNA的制备
• 2.3 亚洲璃眼蜱功能基因的克隆
• 2.4 目的序列的生物信息学和RT-PCR分析
• 3.结果与分析
• 3.1 亚洲璃眼蜱的实验室饲养
• 3.2 目的基因5’端的克隆结果
• 3.3 基因的全长克隆
• 3.4 目的基因AP27的生物信息学和RT-PCR分析
• 4.讨论
• 4.1 PCR特异性的改进
• 4.2 RNA质量对RACE方法的影响
• 4.3 RACE方法在获取未知基因方面的应用
• 4.4 RT-PCR方法在分析目的基因表达变化中的应用
• 4.5 生物信息学与基因功能的预测
• 第二章：亚洲璃眼蜱AP18基因的功能研究
• 1.材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 菌种和试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 主要试剂的配制
• 2.方法
• 2.1 AP18基因的生物信息学和RT-PCR分析
• 2.2 原核表达载体的构建
• 2.3 基因的原核表达
• 2.4 融合蛋白的纯化及浓度测定
• 2.5 动物免疫试验
• 2.6 免疫分析实验
• 3.结果与分析
• 3.1 AP18基因的功能初步预测
• 3.2 AP18／PET32a重组质粒鉴定
• 3.3 AP18／PET32a重组蛋白的原核表核和纯化
• 3.4 蛋白质的浓度测定
• 3.5 琼扩试验
• 3.6 酶联免疫吸附实验
• 3.7 Western Blotting分析抗TRX-AP18血清结果
• 4.讨论
• 4.1 原核表达
• 4.2 蛋白的纯化和复性
• 4.3 Western blot
• 第三章：结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介及硕士期间发表的论文