论文摘要
背景与目的脊肌萎缩症（spinal muscular atrophy,SMA）是世界上最常见的常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病之一,全球不同人种的基因携带者频率为1/40-1/50。其临床特征为身体躯干和四肢近端骨骼肌发生渐进性、对称性肌无力和肌萎缩。根据患者发病年龄和临床表现的严重程度,SMA分为四种临床型,其中儿童型包括三型:Ⅰ型为最严重的急性婴儿型,通常于出生后6个月内发病,不能站坐,两岁内死亡;Ⅱ型为慢性婴儿型,6～18个月内发病,能坐但不能行走,可活至10～20岁;Ⅲ型为青少年型,多于18个月后发病,曾经会走,可存活至成人。Ⅳ型为成人型,常于30-35岁后起病,起病与进展隐匿,以肌无力为主,预后相对良好。SMA致病基因是位于5号染色体长臂1区3带（5q13）的运动神经元存活基因（survival motor neuron,SMN）,人基因组有二个紧邻的高度同源的SMN基因一端粒侧的SMN1和中心粒侧SMN2,这二个基因序列之间仅在3′端有5个碱基不同。SMN1是主要功能基因,SMN2为修饰基因（对病情严重程度起一定缓解作用）,SMN基因功能异常使脊髓前角α细胞变性是导致SMA发生的分子基础。目前已知超过90%的SMA患者为SMN1基因纯合缺失所致,少数病例可由SMN1基因点突变或小的缺失引起。准确检测SMN1/SMN2拷贝数是SMA携带者筛查和临床确诊的重要手段。近几年来随着SMN拷贝数准确定量测定新技术的出现,大大促进了SMA临床遗传学、遗传流行病学、人群筛查和产前诊断的发展。欧美人群的SMA分子遗传学研究已甚为深入,但有关中国人群的SMA相关研究,主要见于一些基于病例的突变鉴定和临床分析,目前尚缺乏中国大陆基于大人群调查的遗传流行病学资料。应用我们改进的变性高效液相色谱（denaturing high performance liquidchromatography,DHPLC）SMN基因拷贝数定量技术,本研究对1712份中国南方新生儿脐带血随机样品进行了准确详细的SMN拷贝数测定,并对比分析了25个中国人SMA核心家系的基因型分布规律,阐明了我国人群的SMA发生率、遗传负荷及其SMN基因序列变异和致病突变特征,可为制订SMA人群筛查和产前诊断预防计划奠定基础。此外,目前国内外的SMA基因诊断技术尚难以满足临床诊断和产前诊断的需求,基于此,本研究根据SMA的基因缺陷特点,发展了进行缺失型SMA快速诊断的反向点杂交（reverse dot bloting,RDB）技术,配合应用DHPLC基因分型技术,可以更好地促进SMA的临床基因分型和产前诊断。人群对象与方法用于分子流行病学调查的普通人群样品为新生儿脐带血,共1712例,以简单随机抽样的方式分别从广东韶关和广州二个地区采集,其中韶关为1220例,采样时间为2006年10月8日到2007年12月28日;广州492例,采样时间为2002年3月15日到2002年7月20日,95%的样品属华南人群。所有样品的目的基因拷贝数测定均采用基于DHPLC半定量的方法进行,其中PCR-DHPLC半变性突变检测法用于SMN1:SMN2比值测定;对于那些用上述半变性技术不能检测的仅含SMN1或SMN1:SMN2=1组成的基因型样品,则采用PCR-DHPLC非变性多片段检测法鉴定样品的SMN拷贝数。采用DNA测序技术对有特异性峰形的样品进行碱基变异分析。根据SMN拷贝数检测结果来诊断样品的SMN基因型,在此基础上确定人群中SMA基因携带者阳性样品,并参考检测得到的SMN1/SMN2基因拷贝数数据评价人群的遗传负荷。用基因记数方法计算出突变位点及其他各个变异位点的基因型频率和等位基因频率,用统计学方法对群体数据进行Hardy-Weinberg平衡吻合度检验。为评价人群中SMA突变基因的分布特征和基因分型方法,我们还收集了25个SMA病例核心家系,SMA家系病例的临床诊断和分型根据临床特征进行。采用上述DHPLC半定量方法检测SMN基因拷贝数,并利用靶基因外显子7、8上的SNP在SMN1和SMN2之间存在差异的序列特点,设计建立了基于PCR扩增的可用于缺失纯合子和不同正常基因型鉴定的反向点杂交技术。采用盲法分析,以DNA测序和DHPLC基因分型结果为对照,我们利用已确定SMN基因型的共181例正常和SMA携带者样品进行了方法学评价。在人群和病例家系样品的分析过程中,少数表现为“异常”的DHPLC图谱的样品,采用DNA序列分析鉴定SMN基因序列的变异或致病突变,并采用逆转录.聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测突变SMN1基因的转录产物,进一步分析其异常剪接机制和进行基因转录水平的功能鉴定。结果与讨论在分子流行病学研究中,我们对所有被测样品的SMN基因拷贝数进行了全面鉴定,在1712份样品中共检测出13种不同的SMN1:SMN2比值（或仅含SMN1基因的样品）及其所对应的SMN1/SMN2基因拷贝数,详细阐明了这些不同SMN基因组合构成的各种等位基因及其基因型的频率,共检测出SMA携带者38例,包含在以下四种比值的个体中:SMN1:SMN2=1:2样品12例、SMN1:SMN2=1:3样品17例、SMN1:SMN2=1:1样品8例和SMN1:SMN2=1:4样品1例,其人群携带者频率为2.22%。其余9种不同SMN拷贝数组合均为“正常”个体的基因型,其中绝大多数为两种基因型个体（SMNl:SMN2=2:2样品986例和SMN1:SMN2=2:1样品463例）,共1449例,人群检出率为84.64%。经统计学检验该群体数据符合Hardy-Weinberg平衡分布。此外,我们还在群体样品调查中发现6种基因单核苷酸变异或小缺失,这些变异包括:IVS6-50A>G 18例,1VS6-24dupT 6例;IVS7+287dupG 3例;c.875C>G 1例;IVS7+288intC 1例;IVS7+137G>T1例;和EX8+204del2 1例。对25个SMA核心家系的25例SMA患者进行分子诊断,检测SMN1纯合缺失23例,杂合缺失2例,其中1例杂合缺失患者经DNA测序证实为内含子6受体位点的剪接突变c.835-1G>A。在这些SMA家系的44例双亲中,检出SMN1:SMN2=1:3样品19例、SMN1:SMN2=1:2样品12例、SMN1:SMN2=1:1样品9例和SMN1:SMN2=2:1样品3例（其中SMN1:SMN2=1+1D:1样品1例）和SMN1:SMN2=1+1D:2样品1例。双亲样品中未发现人群中少见的SMN1:SMN2=1:4样品。上述含剪接突变c.835-1G>A的SMA患儿6个月发病,10个月夭折,患儿的突变遗传自父亲（点突变携带者）,其另一条染色体为SMN1缺失突变,源自其母亲。经RT-PCR分析,该点突变SMN1基因导致产生缺失了SMNl△exon7的异常转录子,与SMN2基因转录子类似。证实c-835-1G>A为SMA致病突变,经文献检索目前世界上未曾报道这一SMN1基因新突变类型。该突变丰富了我国人群的SMA基因突变谱,为临床诊断和遗传咨询提供新的遗传学知识。本研究是国内首先完成的中国南方人群的大样本SMN基因分子筛查,根据我们的调查结果,我们可以准确的计算人群中各种不同基因型的SMA的发生率,与以往的报道一样,SMN1缺失纯合子是SMA患病的主要原因,该地区的SMN1缺失纯合子发生率为12/100,000（95%CI,10.46/100,000～13.54/100,000）,以广东省每年出生100万人口为例,本地区每年出生的SMA患儿约为120人（95%CI,104～6-135.4）。在上述家系分析中获得的三种主要基因型的比例与大人群得到的主要携带者基因型分布基本相符,在家系样品中,我们发现了3例基因型为SMN1:SMN2=2:1（其中2例为2+0型）携带者,占6.82%（3/44）,经采用基于STS扩增的连锁分析的DHPLC图谱诊断,这2例携带者的SMN1拷贝属“2+0”型,即一条染色体上有两个SMN1基因,另一条染色体上SMN1缺如。由于该基因型样品是中国人最常见的基因型之一,其人群基因型频率列第二位,为27%。故我们的结果提示中国人群中这种基因型个体可能“隐藏”着一定比例的SMA携带者个体,是遗传咨询和人群筛查需要注意的一个问题。本文在25个临床病例中发现了1例由点突变导致的SMA,因此,中国人群中的非缺失突变和“2+0”型SMN1拷贝造成SMA均应引起重视。由于SMN拷贝数及其基因型分布的异质性,对在人群筛查和临床诊断中完成SMA的分子诊断提出了较高的技术要求,我们在本研究中发展的基于SMN基因的PCR扩增和扩增序列的SNP分析的RBD技术,以DNA测序和DHPLC检测结果为对照,共对181例RDB法可区分的三大类不同SMN基因型的样品进行了评价,其诊断灵敏性为92%、特异性为100%。RDB法可以很好地区分SMN1缺失纯合子和正常样品,以及区分仅含SMN1的正常样品和其他SMN1:SMN2不同比例的正常基因型样品,不能检测出SMN1基因缺失的SMA携带者。该方法是对SMA基因分型技术的很好补充。联合应用DHPLC技术,该方法对于更好地完成产前诊断是一向值得推行的快速分子诊断技术。在进行SMA携带者的基因筛查中,在基因型为SMN1:SMN2=2:1的样品中检测出SMN1“2+0”型基因携带者,以及区分SMN1:SMN2=2:2和SMN1:SMN2=1:1基因型样品是SMA检测所面临的挑战。我们的研究在这方面进行了一些有益的尝试,为完善SMA技术提供了可供借鉴的经验。本研究所获得的中国南方人群的SMN基因拷贝数分布及其频率数据对于指导进行中国人群的SMA遗传负荷评估有重要价值,相关的SMA基因分型技术的建立和应用经验,可为我国开展以阻止重型SMA患儿出生为目的的人群水平的预防监控计划的制定和实施提供科学依据和技术支持。
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相关论文文献
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