细菌氯霉素类药物耐药基因三重PCR检测试剂盒研究与应用

论文摘要

本研究选择3个氯霉素类药物耐药基因（cat1、cmlA、flor）作为扩增目的基因，建立了单重PCR检测方法，应用该方法筛选出了一株同时携带cat1、cmlA、flor三种耐药基因的阳性菌株（SLPE3-1）以作为试剂盒阳性对照株。本研究对氯霉素类药物耐药基因三重PCR反应体系条件进行了优化，结果显示，最佳反应体系为：在25μl体系中，10×PCR Buffer2．5μl，MgCl2（25mmol／L）3μl，dNTP（2．5mmol／L）4μl，Taq DNA聚合酶0．2μl，上、下游引物（25mmol／L）cat1 0．2μl、cmlA 0．9μl、flor 0．4μl，模板2．5μl，灭菌去离子水9．8μl；最佳反应程序为：94℃预变性5min；然后进入循环：94℃变性50S、54℃退火1min、72℃延伸1min，共32个循环，最后72℃延伸5min。本研究对试剂盒特异性、敏感性、重复性和保质期进行了检测试验。结果表明：本试剂盒具特异性很强，只能特异性扩增出待检测的耐药基因；具有很高的灵敏度（2．4×104CFU／mL）；具有很好的重复性（100％）；试剂盒在-20℃下的保质期为6个月。应用本检测方法和药敏试验方法对33株细菌的耐药性进行检测，结果表明，两者检出结果的符合率为91％。本研究应用本试剂盒对全国21个省规模化养殖场收集的417株细菌进行了氯霉素耐药基因（cat1、cmlA、flor）的检测，结果显示，各省的耐药基因检出率差异较大，三种基因的平均检出率分别为：41．5％、35．7％和37．2％。本研究率先在国内外建立了氯霉素类药物耐药基因（cat1、cmlA、flor）三重PCR检测试剂盒，并应用该试剂盒对417株细菌细菌进行了检测，了解了耐药基因在我国养殖场的分布情况，并为细菌氯霉素类耐药基因检测提供了可靠方法。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 细菌耐药性检测方法研究状况
• 1.2 PCR试剂盒研究状况
• 1.3 氯霉素类药物应用及耐药状况
• 1.4 细菌对氯霉素类药物耐药机理研究
• 1.5 细菌对氯霉素类药物的耐药基因
• 1.6 试剂盒扩增基因的选择
• 1.7 本研究的前期工作基础
• 1.8 本研究的目的意义及创新点
• 1.9 技术路线
• 2 试验材料
• 2.1 试验菌株
• 2.2 试验药品及试剂
• 2.3 试验仪器
• 3 试验方法
• 3.1 引物设计
• 3.2 单基因PCR的扩增
• 3.3 耐药基因的测序
• 3.4 三重PCR反应体系的初步建立
• 3.5 三重PCR反应体系的优化
• 3.6 PCR模板制备方法的选择和优化
• 3.7 三重PCR模板的优化
• 3.8 试剂盒特异性试验
• 3.9 试剂盒灵敏度试验
• 3.10 重复性试验
• 3.11 试剂盒保存期试验
• 3.12 试剂盒的组装
• 3.13 试剂盒的应用
• 3.14 试剂盒操作规程草案
• 4.试验结果
• 4.1 三重PCR引物设计结果
• 4.2 单基因PCR的扩增结果
• 4.3 阳性对照菌株PCR扩增产物测序结果及分析
• 4.4 三重PCR反应体系的初步建立结果
• 4.5 三重PCR反应体系的优化结果
• 4.6 PCR模板制备方法的选择
• 4.7 PCR模板制备方法的优化结果
• 4.8 试剂盒特异性试验结果
• 4.9 试剂盒灵敏度试验结果
• 4.10 试剂盒重复性试验结果
• 4.11 试剂盒保存期试验结果
• 4.12 试剂盒的外包装
• 4.13 试剂盒的应用结果
• 4.14 试剂盒操作规程草案的制订
• 5 分析与讨论
• 5.1 扩增目的耐药基因的选择
• 5.2 关于多重PCR反应目的片段选择及引物设计原则
• 5.3 关于PCR反应模板制备方法的筛选与优化
• 5.4 关于多重PCR反应方法建立和优化的影响因素
• 5.5 影响试剂盒性能的其他因素
• 5.6 试剂盒保存期的影响因素
• 5.7 耐药基因检出率与耐药表型的符合性
• 5.8 关于我国各个省市分离菌中氯霉素耐药基因检出率
• 6 结论
• 参考文献:
• 致谢
• 附件
• 附件1 氯霉素类药物耐药基因多重POR检测试剂盒操作规程
• 附件2 试剂盒可能遇到的问题与解决办法
• 攻读学位期间发表的学术论文目录