应用RNA干扰技术抑制口蹄疫病毒复制与感染的研究

论文摘要

根据RNAi技术原理,设计构建shRNA表达载体,并对该载体在细胞水平及乳鼠体内对口蹄疫病毒的复制与感染[0]的抑制进行了研究,以期筛选到对口蹄疫病毒有良好抑制作用的干扰靶位。本研究以口蹄疫病毒WFL株为研究样本,针对口蹄疫病毒基因组高度保守的IRES、2B、2C和3D区段,选取了19个干扰靶位,构建了包括对照在内的20个shRNA表达质粒;在细胞水平研究表明,针对2B基因的shRNA表达质粒对pEGFP+2B的融合表达有明显抑制作用;细胞攻毒实验证实,pSi-2B16、pSi-2C56和pSi-3D18能够明显抑制口蹄疫病毒在BHK-21、PK-15和IBRS-2三种细胞中复制,最高抑制效率达90%以上,抑制作用最长持续时间可达144h;乳鼠动物模型实验证实,三种质粒单独应用最高可以使50%的3日龄乳鼠耐过50LD50/只剂量的病毒攻击,而且质粒诱导的对病毒感染的抑制作用可以在攻毒后24h内发挥保护效力,但攻毒后应用效果不明显;实验还证明,加大质粒注射剂量和质粒的联合应用能够明显提高对乳鼠的保护率,耐过乳鼠无不良反应,与感染对照组相比,病毒RNA相对表达率最低为0.052%,内脏病变轻微或不呈现病理变化。本研究对应用RNAi技术抑制口蹄疫病毒在体内外的复制进行了成功探索,为RNAi技术在口蹄疫病毒研究和口蹄疫防治中的运用奠定了基础。

论文目录

• 内容提要
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 口蹄疫病毒基因组结构、功能及致病分子机制
• 1 口蹄疫病毒基因组的结构及功能
• 1.1 口蹄疫病毒基因组的基本结构
• 1.2 5＇非翻译区（5＇UTR）
• 1.3 3＇非翻译区（3＇UTR）
• 1.4 开放阅读框（ORF）
• 2 口蹄疫病毒致病的分子机制
• 2.1 口蹄疫病毒的感染过程
• 2.2 口蹄疫病毒的感染对宿主细胞的作用
• 2.3 细胞受体在口蹄疫病毒感染过程中的作用
• 3 FMDV 持续感染机制研究进展
• 3.1 干扰机体免疫反应
• 3.2 免疫逃避
• 3.3 病毒变异
• 第二章 RNA 干扰的分子机制与抗病毒应用
• 1 RNAi 的发现和命名
• 2 RNAi 的分子机制
• 2.1 dsRNA 介导的RNA 干扰
• 2.2 miRNA 介导的RNA 干扰
• 3 RNAi 的生物学意义
• 4 RNAi 在抗病毒感染中的应用
• 4.1 RNAi 技术在抗病毒领域的探索
• 4.2 RNAi 技术运用于抗病毒感染遇到的问题及应对策略
• 第二篇 研究内容
• 第一章 口蹄疫病毒siRNA 的设计及表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 FMDV 基因组IRES、2B、2C、3D 序列同源性分析结果
• 2.2 IRES、2B、2C、3D 序列二级结构预测结果
• 2.3 靶序列的选择结果
• 2.4 siRNA 靶序列自身的二级结构预测结果
• 2.5 靶序列同源性分析结果
• 2.6 表达shRNA 的DNA 插入片段制备
• 2.7 pSilencer 1.0-U6-shRNA 表达质粒的构建及鉴定
• 2.8 重组质粒的大量制备与纯化
• 3 讨论
• 3.1 关于干扰靶区的确定
• 3.2 关于干扰靶区RNA 序列的二级结构预测
• 3.3 关于siRNAs 序列的选择
• 3.4 关于siRNAs 的制备
• 4 小结
• 第二章 质粒表达的shRNA 对2B 基因在BHK-21 细胞中表达的抑制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 2B 基因的RT-PCR 扩增结果
• 2.2 pEGFP+2B 重组质粒鉴定
• 2.3 重组质粒pEGFP+2B 荧光表达检测
• 2.4 shRNA 表达质粒抑制EGFP+2B 融合蛋白表达
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 靶向基因组保守区的RNAi 体外抑制口蹄疫病毒的复制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 口蹄疫病毒的培养及病毒滴度测定
• 2.2 shRNA 表达质粒抑制口蹄疫病毒在BHK-21 细胞中的复制
• 2.3 shRNA表达质粒抑制口蹄疫病毒在PK-15细胞中的复制
• 2.4 shRNA 表达质粒抑制口蹄疫病毒在IBRS-2 细胞中的复制
• 3 讨论
• 3.1 关于不同细胞上的干扰效果
• 3.2 关于pSi-2B4、pSi-2B16、pSi-2C56 和pSi-3D18对病毒抑制作用的分析
• 3.3 关于pSi-IRES20 和pSi-3D72 对病毒无效抑制的分析
• 4 小结
• 第四章 siRNA 对乳鼠口蹄疫病毒感染的抑制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 FMDV WFL 株乳鼠毒价测定结果
• 2.2 shRNA 表达质粒单独应用对FMDV 感染乳鼠的抑制作用
• 2.3 shRNA 表达质粒联合应用对FMDV 感染乳鼠的抑制作用
• 2.4 提高质粒注射量对FMDV 感染乳鼠的抑制作用
• 2.5 荧光定量 PCR 检测乳鼠病料中 FMDV 基因的相对表达
• 2.6 不同干扰组与攻毒对照组的病理组织学分析
• 3 讨论
• 3.1 siRNA 导入方法对病毒抑制效果的影响
• 3.2 siRNA 联合应用对病毒抑制效果的影响
• 3.3 siRNA 的剂量对病毒抑制效果的影响
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 摘要
• 英文摘要
• 致谢
• 导师及作者简介
• CURRICULUM VITAE