靶向缺氧诱导因子HIF-1的抗肿瘤药物筛选的分子模型建立

论文摘要

肿瘤细胞的迅速增殖和肿瘤内部新生血管的紊乱使得缺氧成为实体瘤物理微环境的基本特征之一。越来越多的证据表明缺氧是决定恶性肿瘤预后的重要因素。缺氧不仅可以诱导肿瘤细胞对放疗及化疗的耐受性,更重要的是缺氧还可以促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移等恶性生物学行为的发生。缺氧调控的一系列基因和蛋白的表达正是这些现象发生的根本原因。缺氧诱导因子1（Hypoxia Inducible Factor 1,HIF-1）是调控肿瘤缺氧效应的一类极为重要的转录因子。HIF-1是由α亚基和β亚基组成的异源二聚体蛋白。β亚基在胞内的蛋白水平不受氧水平的影响,而HIF-1α在常氧条件下一经翻译即发生O2依赖的羟基化,进而经由pVHL的介导而被泛素-蛋白酶体系统迅速降解（半衰期小于5min）;在缺氧条件下HIF-1由于不能发生自身的羟基化而能得以稳定,进而转入核内并与HIF--β聚合形成HIF-1蛋白复合物,HIF-1通过与其靶基因上的缺氧反应元件（Hypoxia responsible element, HRE）的结合而发挥其转录活性,从而调控诸如肿瘤血管生成、糖类代谢等多种靶基因的转录、促进肿瘤生长、浸润及转移。以HIF-1为靶点进行抗肿瘤药物的开发也引起了人们越来越多的关注。HIF-1的激活涉及了胞内众多的信号通路,而且HIF-1α蛋白本身存在诸如羟基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、SUMO化等多种修饰,人们在过去十多年中所发现的HIF-1的抑制剂多为非特异性的化合物,因此开发能够特异性的抑制HIF-1的药物成为当前该领域研究的焦点。本论文研究的目的就是拟在体外表达HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区（bHLH /PAS domain）并人工合成HRE（5’-GTGCTACGTGCTGCCCTG -3’）序列,建立能够用于筛选特异性抑制HIF-1与其靶基因结合的新的抗肿瘤药物的分子模型,并对该模型进行评价。第一部分:HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区表达载体的构建本部分实验首先用RT-RNA的方法从人乳腺癌细胞468的cDNA中扩增出带有酶切位点的HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区cDNA,然后通过酶切连接将扩增片断连入pFastBac HTb载体中,经过双酶切和测序选取连接正确的克隆。然后将重组质粒转化DH10α感受态细胞中,通过蓝白班筛选挑取阳性克隆。抽提质粒以用于后续实验.第二部分:HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区的表达、纯化和鉴定本部分实验主要是利用Invitrogen公司的Bac-to-Bac Baculoviruse Expression System进行了蛋白表达,然后用Ni-NTA柱对表达的蛋白进行纯化。再用考马斯亮蓝染色和Western blot方法对表达的重组蛋白进行鉴定。结果表明:得到了HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区重组蛋白,分别命名HIF-1α-RP和HIF-1β-RP。第三部分:HIF-1α-RP和HIF-1β-RP活性分析和ELISA分子模型的建立为了检测重组蛋白的活性我们分别在体外合成了野生HRE序列（wtHRE, 5’-GTGCTACGTGCTGCCCTG -3’）和突变了HIF-1结合位点的突变HRE序列（mtHRE,5’-GTGCTAAAAGCTGCCCTG -3’）并对合成的野生HRE序列进行了3’端生物素标记,然后利用EMSA方法来鉴定重组蛋白复合物和HRE序列的结合能力。随后建立了可用于筛选化合物的酶联免疫吸附法（ELISA）的分子模型,并引入阳性化合物棘霉素对建立的分子模型进行评价。实验结果表明,获得的重组蛋白能够特异性的与HRE序列结合,所建立的ELISA法能够用于后期的药物筛选工作,模型建立成功。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区重组质粒的构建
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 2 HIF-1α和HIF-1β的蛋白结合区重组蛋白的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 3 HIF-1α-RP 和 HIF-1β-RP 活性分析和ELISA 分子模型的建立
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 个人简历