论文摘要
为了对抗严重危害人类健康的恶性肿瘤,药物化学科学家们合成了新型化合物GL3和SMT-A07,前者是对已应用于临床的药物VP16（依托泊苷,etoposide）进行化学结构改造合成的衍生物,后者是新型3-（吲哚-2-基）吲唑衍生物。在本文中,我们对这两个潜在抗肿瘤化合物进行了肿瘤抑制活性测定和机制研究,以求发现两类化合物的各自作用特点,为今后的研究提供一定的数据支持和理论指导。第一部分GL3的抗肿瘤作用及其机制研究目的：VP16是一种已广泛应用于肿瘤治疗的拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ）抑制剂,化合物GL3作为一种全新结构的VP16衍生物,体外实验显示出了比其母体更优秀的抑制肿瘤细胞增殖能力。本课题主要通过测定GL3的体外抗肿瘤活性,探索GL3在人非小细胞肺癌细胞A549和人口腔上皮肿瘤细胞KB上的作用机制。方法：MTT法评价化合物GL3体外对人源性肿瘤细胞株A2780、PC-3、A549、HepG2、HCT-116、SGC和KB的增殖作用,计算IC50值；TopoⅡ介导的DNA剪切-重连接复合物稳定性实验测定GL3对‘TopoⅡ活性的影响；TopoⅠ介导的DNA剪切-重连接复合物稳定性实验测定体外GL3对TopoⅠ活性的影响；EB化合物的DNA嵌入竞争实验测定GL3对双链DNA的嵌入作用；单细胞凝胶电泳实验测定DNA双链断裂；PI染色结合流式细胞术测定细胞凋亡及周期分布情况；Western blot法检测周期、凋亡和DNA双链断裂相关蛋白含量及活性。结果：（1）GL3能抑制肿瘤细胞增殖。GL3对A2780、PC-3、A549、HepG2、HCT-116、SGC、KB细胞均有较好的增殖抑制作用,IC50值在0.82-4.31μM之间,而其母体化合物VP16的IC50值在4.18-39.43μM之间,特别是GL3在A549上的IC50值仅为VP16的1/11,说明GL3的增殖抑制作用比母体化合物VP16更强。（2）GL3具有TopoⅡ靶向能力。分子水平实验显示,GL3能稳定DNA与TopoⅡ形成的共价复合物,抑制TopoⅡ催化活性,相同浓度下对TopoⅡ的抑制活性与VP16类似。但GL3不能稳定DNA与TopoⅡ形成的复合体,也不能与EB竞争嵌入DNA双链。（3）GL3稳定TopoⅡ-DNA复合物,引起DNA双链断裂,诱导肿瘤细胞凋亡。采用5-10倍IC50浓度的GL3分别作用于A549和KB细胞时能引起凋亡,且凋亡率随着作用浓度的升高而增高。在发生凋亡的A549细胞中,p53、p-p53、bax、cleaved caspase-3和PARP裂解片段的蛋白表达水平上调,procaspase-8、procaspase-9、procaspase-3和PARP原型的蛋白表达下调。但当相同浓度VP16作用A549细胞24 h时,除了p53、p-p53和bax的蛋白表达上调外,其余蛋白表达与对照组相比并没有出现变化。KB细胞上,GL3作用后现象类似,cleaved caspase-3和PARP裂解片段的蛋白表达上调,PARP原型的蛋白表达下调。GL3作用细胞1h或2h均能诱导H2AX磷酸化（γ-H2AX）水平表达上调,而当VP16作用1h或2h时,诱导γ-H2AX表达上调的作用效果不明显。单细胞凝胶电泳实验显示,GL3作用细胞2h能引起DNA双链断裂,使细胞在电泳后产生彗尾状拖尾,而当VP16作用2h时,细胞在电泳后不产生彗尾。采用TopoⅡ结合抑制剂Aclarubicin（阿克拉霉素）预孵育A549细胞30 min后再予以GL3作用时,γ-H2AX表达变化程度减弱,单细胞凝胶电泳的彗尾不再出现,说明GL3是一种TopoⅡ毒剂,能引起DNA损伤。（4）GL3激活ATM/ATR通路,诱导肿瘤细胞周期阻滞。采用约1/4IC50浓度的GL3分别作用于A549和KB细胞24 h均能诱导细胞阻滞于G2/M期而不引起明显的凋亡,且G2/M期细胞百分比随着GL3作用浓度的升高而增高。在发生细胞周期阻滞的细胞中,p-Chk2、cyclin B1、Cdc2（T14/T15）的蛋白表达水平随GL3浓度的升高而显著上调,p-Chk 1、Cdc25c（S216）的蛋白表达水平随GL3浓度的升高而下调,Chk2、Cdc2总蛋白表达变化不明显。采用ATM/ATR泛抑制剂caffeine（咖啡因）预孵育A549细胞30 min后再予以GL3作用时,G2/M期阻滞关键蛋白Cdc2（T14/T15）、cyclin B1表达变化程度减弱。结论：GL3具有广泛的肿瘤细胞增殖抑制能力,且增殖抑制作用比其母体化合物VP16更强。机制研究显示,GL3的分子靶点是TopoⅡ,它能影响TopoⅡ-DNA复合物的稳定性,引起DNA损伤。这种损伤积累到一定程度,将促使肿瘤细胞发生凋亡,抑制肿瘤细胞增殖,且相同浓度下GL3诱导凋亡作用和引起DNA双链断裂作用均强于母体化合物VP16。而当GL3对DNA的损伤不足以引起凋亡时,ATM/ATR通路将被激活,G2/M期阻滞关键蛋白表达水平发生改变,使肿瘤细胞发生G2/M期阻滞。第二部分SMT-A07的抗肿瘤作用及其机制研究目的：SMT-A07是一种新型3-（吲哚-2-基）吲唑衍生物,前期实验数据显示其有潜在抗肿瘤作用。本课题主要通过测定SMT-A07的体外抗肿瘤活性,分析SMT-A07在白血病细胞和实体瘤细胞上的不同作用方式,进一步开展对此化合物的抗肿瘤作用机制研究。方法：MTT法评价化合物SMT-07体外对白血病细胞CCRF-CEM、HL60、Molt-4、U937、NB4和实体瘤细胞HCT-116、SW620、HepG2、Bel-7402、T24、5637、A2780、AGS、BGC、A549的增殖抑制作用,计算IC50值；PI染色结合流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况；DAPI染色检测细胞形态和细胞核变化；DNA电泳检测DNA片段化；Western Blotting法检测周期、凋亡相关蛋白表达量变化；JC-1染色结合流式细胞术检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potcntial,△Ψm）变化；免疫荧光观察Cyclin B1蛋白在细胞核内外分布。结果：（1） SMT-A07能抑制白血病细胞和实体瘤细胞增殖。SMT-A07对白血病细胞CCRF-CEM、HL60、Molt-4、U937、NB4均有较好的抑制增殖作用,IC50值在0.09-1.19μM之间；SMT-A07对实体瘤细胞HCT-116、SW620、HepG2、Bel-7402、T24、5637、A2780、AGS、BGC、A549也有较好的抑制增殖作用,1C50值在0.74-17.96μM之间；（2） SMT-A07能诱导白血病细胞凋亡。一方面,0.25μM、0.5μM和1.0μM SMTA07作用HL60细胞24 h后Sub G1期细胞所占比率分别为14.09±5.39%、31.94±10.81%和49.72±8.24%（对照组为6.88±0.64%）,1.0μM SMT-A07作用HL60细胞6h、12h和24 h后Sub G1期细胞所占比率分别为14.01±1.31%、26.41±1.88%和49.72±8.24%（对照组为6.88±0.64%）。另一方面,SMT-A07作用NB4细胞,也呈现出Sub G1期细胞所占比率随着SMT-A07作用浓度增加和时间延长而升高的趋势。HL60和NB4细胞经SMT-A07处理24 h后细胞膜起泡或出“芽”,DAPI染色显示细胞核出现固缩现象或者裂成凋亡小体。采用0.25μM、0.5μM和1.0μMSMT-A07作用HL60细胞24 h,可使细胞DNA样本发生梯状条带,1.0μMSMT-A07作用6h、12h和24 h也可使HL60细胞DNA样本产生明显的梯状条带。相似的,不同时间、不同浓度的SMT-A07作用NB4细胞,也同样可使NB4细胞的DNA样本出现梯状条带。这说明SMT-A07作用下HL60和NB4细胞发生了凋亡。凋亡浓度的SMT-A07作用HL60和NB4细胞,随着浓度升高和作用时间延长,可使细胞内procaspase-3、procaspase-8和bid的蛋白表达逐渐下调,cleaved caspase-3和cleaved caspase-8的表达逐渐上调,并能使PARP的裂解片段（Cleaved Factor, CF）逐渐增多。HL60和NB4细胞预孵育泛caspase抑制剂BOC-D-FMK 30min后再加入1.0μM SMT-A07,发现可显著降低细胞凋亡率,且预孵育组cleaved caspase-3的表达与control组接近,PARP也不产生裂解片段。SMT-A07作用HL60细胞24 h可使线粒体膜低电位的细胞（绿色荧光）的百分比由12.41%上升到84.47%, SMT-A07作用NB4细胞24 h可使线粒体膜低电位的细胞的百分比由5.47%上升到68.46%；（3） SMT-A07可以诱导实体瘤细胞M期阻滞。5.0μM、10.0μM和20.0μM SMT-A07作用于HCT-116细胞24 h分别能够使96.29±0.93%、96.14±1.24%和96.73±0.34%细胞阻滞于G2/M期（对照组G2/M期为25.22±4.77%）；20.0μM SMT-A07作用HCT-116细胞6h、12 h、24h分别能够使75.91±2.23%、91.91±0.11%和96.73±0.34%细胞阻滞于G2/M期（对照组G2/M期为25.22±4.77%）。SMT-A07作用于SW620细胞,随着作用浓度的升高和作用时间的延长也能导致逐渐增强的G2/M期阻滞。5.0μM、10.0μM和20.0μM SMT-A07分别作用于HCT-116细胞24 h或20.0μM SMT-A07分别作用于HCT-116细胞6h、12h和24 h使细胞内cyclin B1和p-Cdc2的表达水平随SMT-A07浓度的升高和作用时间的延长而显著上调,Cdc2总蛋白表达变化不明显。不同时间、不同浓度的SMT-A07作用于SW620细胞也能观察到这些蛋白表达的类似变化。另外,免疫荧光法观察经SMT-A07、经典M期阻滞剂Taxol（紫杉醇）和经典G2期阻滞剂VP16作用后的HCT-116细胞内细胞周期蛋白Cyclin B1的分布情况,发现VP16和Taxol处理过后HCT-116细胞的Cyclin B1分别分散于细胞质和细胞核中,SMT-A07处理过后HCT-116细胞的Cyclin B1集中于细胞核中,说明SMT-A07可使肿瘤细胞阻滞于M期。结论：SMT-A07抗瘤谱较广,能抑制多种白血病细胞和实体瘤细胞增殖。它通过不同的机制作用于白血病细胞和实体瘤细胞：SMT-A07能通过引起凋亡杀死白血病细胞,这种作用是caspase通路依赖的,与线粒体膜电位的降低密切相关；SMT-A07不能明显诱导实体瘤细胞凋亡,但能影响实体瘤细胞内周期调控蛋白的表达水平,使之阻滞于M期,从而抑制实体瘤细胞的增殖。
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