阿维链霉菌异柠檬酸脱氢酶的异源表达、纯化及酶学性质研究

论文摘要

异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）属于β-脱羧脱氢酶家族（β--decarboxylating dehydrogenase family）,以NAD+或NADP+为辅酶催化异柠檬酸氧化脱羧,生成α-酮戊二酸,CO2和NAD（P）H。它是三羧酸循环中的关键酶之一,不仅为生物体的新陈代谢提供能量,也为细胞内生物大分子的合成提供前体物质和必不可少的还原力。以NADP+为辅酶的IDH可以分为单体型IDH和二聚体型IDH。目前,对二聚体型IDH的研究已比较广泛,包括系统发育、酶学性质、晶体结构以及调节机制等方面。相比之下,对单体IDH的研究远不及二聚体型IDH广泛和深入。本实验根据GeneBank中已知的基因序列,首次成功地从阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis MA-4680）中扩增和克隆了异柠檬酸脱氢酶（简称SaIDH）基因,并在大肠杆菌中实现了异源高效表达,同时进行了纯化和酶学性质的分析。SDS-PAGE显示,纯化后的SaIDH分子量大小约80 kDa,是一典型的单体IDH。酶学性质研究发现,SaIDH是二价金属离子依赖型IDH,Mn2+是其最适激活剂。Mn2+存在时,SaIDH的最适pH是9.4,最适反应温度约45℃;热稳定性研究发现,在37℃下处理20 min,SaIDH的残余活力为原先的50%。当Mn2+存在时,SaIDH对辅酶NADP+的专一性是辅酶NAD+的33,000倍。本工作以实验证明了SaIDH是一个二价金属离子依赖性的单体IDH,并对辅酶NADP+具有很高的亲和力。本研究不仅为进一步探索单体IDH的催化机制、晶体结构和单体与同源二聚体IDH之间的进化关系奠定了基础,同时鉴于IDH的在代谢途径中的重要地位,也将有助于阿维链霉菌次级代谢产物利用方面的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 链霉菌简介
• 1.1 链霉菌生活习性及形态特性
• 1.2 链霉菌基因组的结构特征
• 1.3 阿维链霉菌
• 2 异柠檬酸脱氢酶
• 2.1 异柠檬酸脱氢酶的分类
• 2.2 NADP-IDHs 的空间结构
• 2.3 NADP-IDHs 的催化机制
• 2.4 NADP-IDHs 活性的调节
• 2.5 NADP-IDHs 的生物学功能
• 2.6 单体IDH 和二聚体IDH 之间的进化关系
• 3 β-脱羧脱氢酶家族（β-decarboxylating dehydrogenase family）
• 4 研究意义和展望
• 参考文献
• 第二章 阿维链霉菌异柠檬酸脱氢酶表达、纯化及酶学性质研究
• 1 实验材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 SaIDH 基因的克隆与鉴定
• 2.2 SaIDH 基因序列分析
• 2.3 SaIDH 的表达及纯化
• 2.4 SaIDH 的酶学性质
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附：本人在读研期间发表和合作的科研论文及获奖情况一览表