慢病毒介导的Foxa2和Hnf4a组成性表达对胚胎干细胞向肝细胞分化的影响

论文摘要

肝炎病毒、药物、酒精等因素引起的肝功能衰竭（简称肝衰竭）是临床治疗中的一大顽疾。迄今,肝脏移植是唯一证实有效的治疗手段,但其受到肝脏来源缺乏、手术费用昂贵等因素的限制。生物人工肝、肝细胞移植、肝组织工程的研究为终末期肝病的治疗带来新的希望,但缺乏有效的肝细胞来源是这三者临床应用的最大瓶颈。胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）,由于具有多向分化、自我更新、无限增殖的特性,有望成为新的肝细胞来源。然而,目前仍缺乏有效的ESCs向肝细胞定向诱导分化策略。近年来,随着对细胞可塑性的重新认识,越来越多的证据证实转录因子在细胞的命运归属与转换中发挥着决定性的作用,少量关键的转录因子可以直接促进各类细胞发生分化、去分化以及转分化。我们推测,是否存在特定的转录因子或转录因子组合可以促进ESCs向肝细胞定向分化。已知叉头框A2（forkhead box A2,Foxa2）与肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4 alpha , Hnf4a）是分别在肝脏发育早期和中期开始表达的两个肝脏核心转录因子,在促进肝脏发育与维持肝细胞功能中发挥着核心的作用。共组成性表达Foxa2和Hnf4a对ESCs向肝细胞的定向分化有何影响尚无相关研究报道。为此,本研究探索了组成性表达Foxa2和Hnf4a对ESCs向肝细胞定向分化中的影响,试图为从ESCs获取肝细胞提供一种新模式。快捷而高效的ESCs基因修饰是本文研究的前提,而ESCs是难以进行基因修饰的细胞之一。质粒转染、腺病毒等瞬时基因修饰方法不适用于ESCs。第三代慢病毒表达载体具有可稳定介导外源基因整合入目的细胞基因组、可感染静止期细胞和相对安全等特点,是进行ESCs基因修饰的较好选择。但第三代慢病毒表达载体包装制备难度大,ESCs对其进入细胞内具有一定程度的抵抗,在ESCs中目的基因容易发生基因沉默。另外,ESCs的维持培养需要在含白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor, LIF）的特殊培养基中,并且一般需要小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）作为饲养层细胞。在进行基因修饰时,阳性克隆的筛选和ESCs特性的维持是一大难题。因此,有必要探索优化第三代慢病毒表达载体的构建、包装制备以及慢病毒介导的ESCs基因修饰等方法。为此,本研究拟首先构建适于荧光示踪标记、利于ESCs基因修饰和稳定表达的系列第三代慢病毒表达载体。其次,基于磷酸钙转染系统与携带绿色荧光的慢病毒表达载体2K7bsd-EFp-EGFP,探索大量、高效包装制备慢病毒的方法,并利用该方法包装制备携带Foxa2和Hnf4a的慢病毒颗粒。然后,利用制备的2K7bsd-EFp-EGFP慢病毒颗粒和小鼠胚胎干细胞株CCE,建立ESCs快速基因修饰的方法,并采用该方法制备组成性表达Foxa2和Hnf4a的ESCs。最后,基于携带有外源基因的ESCs和不同的诱导环境,评价Foxa2和Hnf4a单独和共同组成性表达（Constitutive Expression）对ESCs向肝细胞诱导分化的影响。本研究的主要研究方法和结果如下:1.利用第三代慢病毒表达载体2K7bsd和2K7neo、人延长因子1A启动子（human elongation factor 1 alpha promoter, EFp）、小鼠白蛋白增强子启动子（mouse albumin enhancer promoter, ALBep）、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（woodchuck hepatitis virus posttranscriptional response element,WRPE）、编码人源Foxa2和Hnf4a全长开放阅读框（open reading frame,ORF）的cDNA等元件,成功的构建了适于荧光示踪标记和利于ESCs基因修饰和稳定表达的系列慢病毒表达载体2K7bsd-EFp-EGFP, 2K7neo-EFp-Foxa2, 2K7bsd-EFp-Hnf4a, 2K7bsd-ALBep-EGFP。2.基于磷酸钙转染的方法,利用293FT细胞、包装质粒（pLP1、pLP2、pLP/VSVG）和慢病毒表达载体2K7bsd-EFp-EGFP,从质粒的浓度和质量、表达载体质粒和包装质粒四种质粒的比例,转染液的pH值、293FT细胞状态、转染的时机、慢病毒的收获浓缩以及滴度测定等方面进行了优化,探索出了一套慢病毒表达载体的高效包装和大量制备的方法。并利用优化的制备慢病毒颗粒的方法,大量包装制备了慢病毒颗粒2K7bsd-EFp-EGFP, 2K7neo-EFp-Foxa2, 2K7bsd-EFp-Hnf4a。3.建立了大量制备、处理和冻存小鼠胚胎成纤维细胞的方法,并且该方法廉价、方便,适合小鼠ESCs的维持培养。4.利用前期制备的2K7bsd-EFp-EGFP慢病毒颗粒,从慢病毒的感染时机和方式、ESCs培养基、感染后药物筛选时间、饲养层细胞的添加、克隆挑选等方面优化了慢病毒介导的小鼠ESCs基因修饰方法。探索出了一套高效快速的慢病毒介导的小鼠ESCs基因修饰的方法。利用前期制备的慢病毒颗粒和以上摸索好条件的小鼠ESCs基因修饰方法,进行了ESCs的基因修饰,成功构建了CCE-EGFP、CCE-Foxa2, CCE-Hnf4a, CCE-Foxa2/Hnf4a的细胞株。并通过了PCR酶切鉴定和蛋白免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光检测鉴定。5.进行了CCE,CCE-Foxa2, CCE-Hnf4a, CCE-Foxa2/Hnf4a维持培养和畸胎瘤形成实验,结果提示经过基因修饰的ESCs,仍然能维持ESCs正常增殖和形态特征。将四种细胞移植到裸鼠体内均能畸胎瘤,并在其中均可发现内中外三个胚层的细胞组织,四者之间无明显差异。6.将CCE、CCE-Foxa2、CCE-Hnf4a、CCE-Foxa2/Hnf4a四种细胞在不同的诱导培养环境中,通过形态观察、实时荧光定量PCR检测、免疫荧光检测等监测指标,探索了Foxa2和Hnf4a组成性表达对ESCs向肝细胞分化的影响。结果提示在自发分化、无任何外界诱导剂的情况下,四种细胞在向肝细胞分化方面无明显差异。而在含有DMSO等诱导剂的协助下,Foxa2可明显的促进ESCs向肝细胞分化。同样的条件下,Hnf4a并无明显的促进ESCs向肝细胞分化的作用,而在Foxa2和Hnf4a共同的作用下,有一定的促进ESCs向肝细胞分化作用,但效果并不如单独Foxa2作用明显。总之,本研究在前期首先构建了课题所需的系列第三代慢病毒表达载体,基于磷酸转染方法,探索了一套高效而大量的慢病毒表达载体包装制备方法,制备了相关的慢病毒颗粒;而后进行了慢病毒介导的ESCs快速基因修饰研究,制备了可稳定表达目的基因的ESCs株;并利用这些细胞进行了组成性表达Foxa2和Hnf4a对ESCs向肝细胞分化影响的初步研究。本研究为进行ESCs基因修饰相关研究提供了稳定可靠的方法和工具,也为进一步研究其它转录因子在ESCs定向分化中的作用提供了新的思路与实验依据。

论文目录

• 主要英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 慢病毒介导的Foxa2 和Hnf4a 组成性表达对胚胎干细胞向肝细胞分化的影响
• 前言
• 第一部分 第三代慢病毒表达载体的构建、高效包装和大量制备
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 慢病毒介导的小鼠胚胎干细胞的基因修饰
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 组成性表达Foxa2 和Hnf4a 对胚胎干细胞向肝细胞分化的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 全文结论
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 干细胞治疗肝病的研究现状
• 参考文献
• 英文评述 联合移植iPS 细胞来源的肝细胞和MSCs 治疗终末期肝病
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表文章目录
• 英文论著