蛇足石杉中石杉碱甲和石杉碱乙的分离纯化研究

论文摘要

石杉碱甲（Huperzine A，HupA）是草药蛇足石杉中存在的天然生物碱，是一种强效、可逆性的乙酰胆碱酯酶抑制剂（AChE inhibitor），可以用于治疗阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s disease，AD）和其他记忆障碍病症，因此成为研究人员关注的热点。与石杉碱甲结构相似的石杉碱乙（Huperzine B，HupB）也具有一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性，天然石杉碱甲和石杉碱乙及以其骨架来合成的类似物被大量用于药理、药效和临床研究。然而，石杉碱甲和石杉碱乙在石杉科植物中含量很低，药源植物资源的匮乏已成为发展新型药物的瓶颈。科学利用有限的植物资源非常重要，为此本研究目的是开发一种快速和低成本的HupA和HupB分离纯化工艺，对不同提取和纯化的方法进行比较，建立一套精确的检测和分离方法，并对其中关键的改性剂进行了研究，最后对反相制备色谱分离进行了优化。此外，本研究还进行了对蛇足石杉内生真菌的筛选和初步活性研究。1、确定了高效液相色谱检测HupA和HupB的流动相条件：0.1%TFA，18%甲醇，1mL/min，该方法快速、准确，证实了不同产地蛇足石杉中的含量差异。研究发现添加改性剂可以有效改善HupA和HupB的分离，减少拖尾，酸改性剂对流动相pH的调节作用对保留时间和分离度有很大影响，三氟乙酸（TFA）是最佳的酸改性剂。2、比较了传统浸提、超声提取和闪式提取法提取HupA和HupB的效果，初步纯化用树脂法和萃取法的差别。超声提取得率可达75%，操作简单易放大，更加适合工业生产；较之于其他树脂，弱极性大孔树脂SP850吸附解吸效果最好，可以有效浓缩提取液100倍以上，HupA和HupB回收率都在90%以上。3、优化了制备色谱分离HupA和HupB的进样量和流速，最佳条件：0.1%TFA，流速8mL/min，上样量40mg，同时得到HupA和HupB纯度均在98%以上，总回收率分别为83%和81.8%。4、从安徽黄山、福建三明的蛇足石杉植株中分离出52株内生真菌。用75%乙醇浸泡3min，15%次氯酸钠处理15-18min可以达到最好的消毒效果，分离得到的青霉属内生真菌可能产生抑菌性物质和石杉生物碱类物质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 蛇足石杉
• 1.1.1 蛇足石杉的植物学分类和形态特征
• 1.1.2 蛇足石杉分布和生境
• 1.1.3 蛇足石杉的资源和繁育研究
• 1.2 石杉碱甲和石杉碱乙
• 1.2.1 石松生物碱
• 1.2.2 石杉碱甲和石杉碱乙的化学结构性质
• 1.2.3 石杉碱甲的药理作用
• 1.2.3.1 胆碱脂酶的抑制作用
• 1.2.3.2 作用于脑内神经递质和胆碱能受体
• 1.2.3.3 抗氧化作用
• 1.2.3.4 抗凋亡作用
• 1.2.4 石杉碱甲的临床应用研究
• 1.2.4.1 治疗老年痴呆症 AD
• 1.2.4.2 治疗血管性痴呆 VD
• 1.2.4.3 改善记忆功能和精神恢复治疗
• 1.2.5 石杉碱乙的药理作用
• 1.2.6 石杉碱甲和石杉碱乙的来源
• 1.2.6.1 天然植物来源
• 1.2.6.2 化学合成来源
• 1.2.6.3 新来源的研究进展
• 1.3 生物碱分离纯化的进展
• 1.3.1 中药和天然活性产物
• 1.3.2 天然产物分离纯化的技术特点
• 1.3.3 生物碱分离纯化的方法
• 1.3.3.1 生物碱分离纯化的一般方法
• 1.3.3.2 生物碱分离纯化的新方法
• 1.3.4 石杉碱甲和石杉碱乙的纯化分离
• 1.4 植物内生真菌及其代谢活性的研究
• 1.4.1 植物内生真菌的定义
• 1.4.2 内生真菌产活性化合物的发现和机理
• 1.4.3 产石杉碱甲内生真菌的研究进展
• 1.5 选题的立意和研究方法
• 1.5.1 选题的意义
• 1.5.2 研究方法和内容
• 第二章 石杉碱甲和石杉碱乙的检测方法的建立
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 液相色谱检测条件
• 2.2.2 流动相条件的确定
• 2.2.2.1 标准母液的配置
• 2.2.2.2 流动相溶剂的选择
• 2.2.2.3 流动相改性剂的选择
• 2.2.3 标准曲线的确立
• 2.2.3.1 标准曲线
• 2.2.3.2 精密度实验
• 2.2.3.3 加样回收率实验
• 2.2.4 定量检测石杉碱甲和石杉碱乙
• 2.2.4.1 定量检测石杉碱甲和石杉碱乙的条件和方法
• 2.2.4.2 样品的制备
• 2.2.4.3 不同产地蛇足石杉原料中石杉碱甲和石杉碱乙的定量检测
• 2.3 本章小结
• 第三章 石杉碱甲和石杉碱乙的提取和纯化
• 3.1 实验材料和仪器
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 实验材料
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 提取方法的确定
• 3.2.1.1 提取溶剂、时间和物料比的选择
• 3.2.1.2 提取步骤
• 3.2.1.3 粗提方法的比较
• 3.2.2 树脂的筛选
• 3.2.2.1 树脂的预处理
• 3.2.2.2 树脂的静态吸附解吸实验
• 3.2.3 大孔树脂 SP850 动态实验
• 3.2.3.1 树脂柱的装填
• 3.2.3.2 SP850 动态实验上样量的确定
• 3.2.3.3 洗脱剂条件的确定
• 3.2.3.4 SP850 树脂纯化生物碱粗品的制备
• 3.2.4 纯化方法的比较和选择
• 3.2.4.1 离子树脂动态预实验
• 3.2.4.2 液液萃取实验
• 3.2.4.3 纯化方法的选择
• 3.2.5 制备色谱分离条件的预实验
• 3.2.6 低压 C18 色谱柱纯化
• 3.2.6.1 低压 C18 反相填料的装填
• 3.2.6.2 低压 C18 色谱纯化条件的确定
• 3.2.6.3 低压 C18 色谱纯化石杉碱甲和石杉碱乙
• 3.2.7 高效液相色谱制备分离 HupA 和 HupB 纯品
• 3.2.7.1 制备色谱流动相梯度条件的优化
• 3.2.7.2 不同浓度 TFA 改性剂的比较
• 3.2.7.3 上样量和流速的优化选择
• 3.2.8 制备得产品的纯度和结构鉴定
• 3.2.8.1 HPLC-DAD 全波长检测
• 3.2.8.2 质谱核磁鉴定
• 3.3 本章小结
• 第四章 蛇足石杉内生真菌的分离和代谢活性初步研究
• 4.1 实验材料和仪器
• 4.1.1 实验仪器及工具
• 4.1.2 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 蛇足石杉外植体消毒方法的确定
• 4.2.1.1 外植体消毒的步骤方法
• 4.2.1.2 表面消毒条件的确定
• 4.2.2 内生真菌的筛选和初步鉴定
• 4.2.2.1 纯化筛选内生真菌的方法
• 4.2.2.2 部分菌种的初步鉴定
• 4.2.3 内生真菌发酵和其代谢活性的研究
• 4.2.3.1 内生真菌发酵培养的方法
• 4.2.3.2 四种内生真菌抑菌性的初步检测
• 4.2.3.3 菌丝体的提取和发酵产物的 HPLC 检测
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论和展望
• 5.1 全文结论
• 5.2 展望和建议
• 参考文献
• 附录一 实验仪器和设备
• 附录二 实验材料与药品
• 研究成果及发表的学术论文
• 致谢
• 作者和导师简介
• 附件