近江牡蛎天然免疫相关蛋白的分子生物学及功能研究

论文摘要

牡蛎等无脊椎动物的天然免疫相关蛋白及其与病原的相互作用是国际病害与分子免疫学研究的热点问题。类立克次体是一类专性细胞内寄生的革兰氏阴性细菌,可引起牡蛎的大规模死亡,但目前在贝类抗RLO感染机理方面所知甚少。本博士学位论文在对近江牡蛎天然免疫相关蛋白的基因（sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38）和／或蛋白质结构的分子生物学进行研究的基础上,对它们的功能进行了研究,即：一方面采用类立克次体对近江牡蛎宿主进行诱导刺激,系统地分析了宿主与类立克次体病原的相互作用：即牡蛎sTRAIL,Tolloid-like,MAK3和p38在类立克次体诱导的宿主免疫反应中的功能、作用机制,以及sTRAIL在免疫反应中的信号传导通路。另一方面本研究系统地探索研究了sTRAIL对牡蛎正常血淋巴细胞和肿瘤细胞的细胞毒作用及其作用机制和信号传导通路。一、关于近江牡蛎sTRAIL促细胞凋亡及抗类立克次体感染免疫的研究取近江牡蛎血淋巴细胞,采用TRIzol法提取总RNA,制备cDNA模板。根据人和不同动物TRAIL基因序列设计引物,采用RT-PCR技术首次在双壳贝类中获得了CasTRAIL的编码序列。该cDNA序列含有一个501 bp的读码框,编码一个18.4kDa的蛋白,该蛋白含有一个典型的TNF结构域。CasTRAIL与人的TRAIL基因同源性较高,两者的cDNA序列同源性为99%,氨基酸序列的同源性为98%；与草鱼的同源性则较低,为42%。各组织原位杂交和RT-PCR结果表明：CasTRAIL在牡蛎各正常组织中均有表达,在外套膜、血淋巴和鳃中表达量较高,性腺中表达量很低,提示该基因可能与免疫调节有关。通过构建重组表达质粒pET-CasTRAIL,在大肠杆菌中对CasTRAIL进行了诱导表达,并纯化蛋白制备了多克隆抗体；同时,利用该抗体对牡蛎TRAIL的亚细胞定位进行了研究：结果表明CasTRAIL在大肠杆菌中得到了高效表达,所制备的兔多克隆抗体的效价为1：4000；牡蛎TRAIL蛋白主要表达于血淋巴细胞的细胞膜上,是一个跨膜蛋白。随后利用Real time RT-PCR、流式细胞仪、DNA电泳、Western blotting和抗体技术等探索研究了CasTRAIL对牡蛎正常血淋巴细胞和肿瘤细胞的细胞毒作用及其作用机制和信号传导通路。结果证明：CasTRAIL可通过激活死亡受体（DR4和DR5）途径引起人类肿瘤细胞HL-60的凋亡；对正常牡蛎血淋巴细胞无毒性,但可引起p38和ERK等磷酸化水平的提高,表明MAPKs与CasTRAIL信号传导的和功能有关。接着,利用原位杂交、Real time RT-PCR技术探索研究了CasTRAIL在类立克次体诱导刺激条件下的激活机理及其功能。结果显示：CasTRAIL在外套膜、血淋巴和肌肉中明显增强,在鳃中显著降低,而在性腺中则未见明显变化,表明CasTRAIL在类立克次体诱导的宿主免疫反应中具有功能。二、类立克次体诱导刺激后近江牡蛎Tolloid-like、MAK3和p38MAPK基因的克隆与鉴定我们进一步克隆鉴定了近江牡蛎的Tolloid-like,MAK3和p38基因,并对它们的功能进行了初步研究。①CaTLL全长3492 bp,具有一个2811 bp的读码框,编码含936个氨基酸、分子量大小约103 kDa的蛋白,该蛋白含有虾红素超家族成员几个特征性结构域或基序：astacin-like结构域、按CUB-CUB-EGF-CUB-EGF-CUB-CUB排列的CUBs和EGFs结构域、RTRR基序、zn2+结合基序：HELGHVIGFWHEH和Met-turn:SIMHY。其中astacin-like结构域与其它动物该结构域的相似度在30%—97%之间,提示其催化功能的保守性。RT-PCR结果显示：CaTLL在各正常组织中均有表达,在鳃中的表达量较高,在血淋巴细胞中的表达量显著偏低；而实时定量PCR结果显示：类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中CaTLL的表达明显增强,表明CaTLL与RLO诱导的宿主免疫反应有关。②CaMAK3基因的编码序列长510 bp,具有一个510 bp的完整读码框,编码169个氨基酸、分子量大小约18.6 kDa的蛋白,该蛋白的特征性结构域Acetyltransf1与酵母菌的相似度为27%；与各种动物的相似度在53%--100%之间,是一个非常保守的结构域。RT-PCR结果显示：CaMAK3在各正常组织中均有表达,其中鳃和血淋巴细胞中表达量较高,外套膜和闭壳肌中的表达量较低；而在类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中的表达明显增强,表明CaMAK3与RLO诱导的宿主免疫反应有关。③Cap38全长1244 bp,含有一个1065 bp的完整读码框,编码355个氨基酸的蛋白质,其分子量近39 kDa。该蛋白含有一个保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶催化结构域STKc,该结构域和其它动物的相似度在62%和77%之间,说明p38蛋白是一个较保守的激酶。RT-PCR结果显示：p38在各组织中均有表达,其中鳃、血淋巴细胞和外套膜中表达量较高；而在类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中Cap38的表达水平在15min后即迅速增至峰值,表明Cap38在RLO诱导的宿主免疫反应中具有一定作用。综合上述结果得到如下结论：CasTRAIL在类立克次体诱导的免疫反应中,类立克次体可以诱导增强CasTRAIL的表达水平,证明了CasTRAIL具有免疫功能,且CasTRAIL重组蛋白诱导试验证明CasTRAIL可从mRNA和蛋白两个水平上同时激活p38-MAPK的表达,表明在CasTRAIL介导的抗类立克次体感染的免疫反应中,可能和p38-MAPK介导的信号通路有关；而Tolloid-like,MAK3和p38等基因在类立克次体诱导的宿主免疫反应中都具有一定的功能。鉴于这些结果,病原/TRAIL/MAPKs/信号途径可能存在于牡蛎天然免疫系统中,而Tolloid-like,MAK3可能在对该信号途径进行调节、修饰等方面发挥一定作用,从而共同抵御外来病原的入侵。另外,通过检测p38, ERK, JNK等MAPks激酶磷酸化水平的变化,证明CasTRAIL蛋白对正常血淋巴细胞无毒性作用,但对人类的肿瘤细胞具有细胞毒作用,可引起肿瘤细胞HL60的凋亡,并且该作用是通过死亡受体（DR4和DR5）介导的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分 文献综述、研究内容与技术路线
• 第一章 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）的研究进展
• 1 TRAIL的生物学特点
• 2 TRAIL的受体
• 3 TRAIL诱导细胞凋亡的途径
• 4 细胞逃逸TRAIL杀伤作用的机制
• 5 TRAIL在人类肿瘤治疗中的应用
• 6 贝类TRAIL的研究及其意义
• 第二章 研究内容与技术路线
• 1 研究内容
• 2 技术路线概要
• 第二部分 近江牡蛎sTRAIL促细胞凋亡及抗类立克次体感染免疫的研究
• 第三章 近江牡蛎sTRAIL（CasTRAIL）cDNA序列的克隆与分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 2 结果
• 2.1 总RNA的制备
• 2.2 CasTRAIL cDNA片段的克隆与鉴定
• 2.3 CasTRAIL cDNA的序列分析
• 3 讨论
• 第四章 CasTRAIL的原核表达与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CasTRAIL原核表达载体的构建与酶切鉴定
• 2.2 重组蛋白的表达与纯化
• 2.3 多克隆抗体制备
• 2.4 Western blot分析
• 3 讨论
• 第五章 近江牡蛎TRAIL的组织表达与亚细胞分布
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 近江牡蛎TRAIL基因在正常组织中表达的RT-PCR检测
• 2.2 近江牡蛎TRAIL基因表达的原位杂交检测
• 2.3 近江牡蛎TRAIL蛋白的亚细胞分布
• 3 讨论
• 第六章 CasTRAIL对牡蛎血淋巴细胞和肿瘤细胞的毒性作用与及其机制分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CasTRAIL对牡蛎血淋巴细胞的细胞毒性作用
• 2.2 CasTRAIL对血淋巴细胞中MAPKs（p38、ERK和JNK）磷酸化水平的影响
• 2.3 CasTRAIL对肿瘤细胞HL-60凋亡的促进作用
• 3 讨论
• 第七章 CasTRAIL在抗类立克次体（RLO）感染免疫反应中的功能与作用机理分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CasTRAIL在RLOs感染免疫反应中的功能
• 2.2 CasTRAIL对牡蛎血淋巴细胞中p38和LITAF基因表达水平的影响
• 3 讨论
• 第三部分 类立克次体诱导刺激后近江牡蛎Tolloid-like、MAK3和p38EAPK基因的克隆与鉴定
• 第八章 类立克次体诱导刺激下近江牡蛎Tolloid-like基因的克隆、表达与功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CaTLL基因片段的的克隆
• 2.2 CaTLL cDNA全长的克隆与序列分析
• 2.3 近江牡蛎不同组织中CaTLL的表达分析
• 2.4 类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中CaTLL的表达分析
• 3 讨论
• 第九章 类立克次体诱导刺激下近江牡蛎MAK3基因的克隆、表达与功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 CaMAK3基因片段的的克隆
• 2.2 CaMAK3的序列分析
• 2.3 CaMAK3原核表达载体的构建与鉴定
• 2.4 近江牡蛎不同组织中CaMAK3的表达分析
• 2.5 类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中CaMAK3的表达分析
• 3 讨论
• 第十章 类立克次体诱导刺激下近江牡蛎p38基因的克隆、表达与功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 Cap38基因片段的的克隆
• 2.2 Cap38全长cDNA的克隆与序列分析
• 2.3 近江牡蛎不同组织中Cap38的表达分析
• 2.4 类立克次体诱导刺激后血淋巴细胞中Cap38的表达分析
• 3 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 附录 攻读博士期间发表的论文与专利
• 致谢