北高丛越橘内生真菌的分离、鉴定及次生代谢产物的研究

论文摘要

内生真菌普遍存在于植物体中,其重要性正日益受到关注,内生真菌是在植物体内渡过全部或部分生活周期,而不使宿主植物表现出明显的病害症状的真菌。不同植物体内的内生真菌种类与数量也不相同,自然界中存在大量的内生真菌资源有待开发。现已有报道表明,由药用植物中分离得到的内生真菌,能够产生与其宿主植物相同或相似的化学成分。本研究选取北高丛越橘（Vaccinium corymbosum L.）为研究材料,首次进行其内生真菌资源的研究工作。并通过形态学和分子生物学方法对所分离的菌株进行了鉴定。同时对菌株H2进行了次生代谢产物的分离。实验结果如下:1.采用组织块分离法,以PDA和TWA培养基为内生真菌分离培养基,在25℃下避光培养,对内生菌进行分离。实验发现以组织块印迹法对组织块表面消毒效果进行检测结果更加可靠,更灵敏。由北高丛越橘的健康叶片中分离得到54株内生真菌,其中25株内生真菌属于链格孢属（Alternaria sp.）,22株内生真菌属于拟盘多毛孢属（Pestalotiopsis sp.）,且分离率较高,分别达到46%和41%。2.对链格孢属内生真菌菌株H1和拟盘多毛孢属内生真菌菌株H2进行生长曲线的测定,结果发现两种内生真菌的生长曲线几乎都是近于“S”型,在正常的培养情况下,15天左右可长满全皿。为分离提取代谢产物的最佳时期提供参考。3.运用分子生物学技术进一步对菌株H1进行了鉴定。采用CTAB法提取DNA。以ITS1和ITS4为引物,对H1的DNA进行了PCR扩增,并对扩增产物进行了测序,结果表明:这种内生真菌与已有的链格孢属真菌—豆链格孢（Alternaria azukiaein）的同源相似性达到99%。4.对菌株H2的次生代谢产物进行了分离和纯化。利用硅胶柱层析,以CHCl3:MeOH（10:1至10:10）为洗脱液,分离得到5种化学成分（C-2,C-3,C-4,C-5,C-6）。通过薄层层析发现C-2和C-6与原植物叶片的乙酸乙酯部分具有相同的Rf值。并对C-6进行波谱分析,经质潜、红外光谱、核磁共振谱检测和查阅文献对照,可以确定化合物C-6为倍半萜内酯类化合物,分子式为C15O2H22,为我们进一步研究北高丛越橘内生真菌的次生代谢产物奠定了基础。本文的创新点:本实验采用组织分离的方法首次从北高从越橘的健康叶片中分离到内生真菌,并确定了其优势种群为链格孢属和拟盘多毛孢属。本实验首次对北高丛越橘的内生真菌H2进行次生代谢产物的研究,并通过化学成分的初步检验,确定了化合物的分子式和结构。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一章 越橘及植物内生真菌研究概况
• 1.1 越橘及其有效成分的研究进展
• 1.1.1 越橘的概况
• 1.1.2 越橘的药用成分研究进展
• 1.2 内生真菌的概况
• 1.2.1 植物内生真菌的特性
• 1.2.2 植物内生真菌的生物学作用
• 1.3 药用植物内生真菌研究进展
• 1.4 内生真菌次生代谢产物的研究方法
• 1.5 内生真菌的次生代谢产物及其活性
• 1.5.1 具有抑菌活性的次生代谢产物
• 1.5.2 具有抗肿瘤活性的次生代谢产物
• 1.5.3 具有抗氧化活性的次生代谢产物
• 1.5.4 抗生素类活性物质
• 1.6 问题与展望
• 第二章 北高丛越橘内生真菌的分离培养及鉴定
• 2.1 材料、仪器及试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物组织表面消毒
• 2.2.2 表面消毒的效果的检测
• 2.2.3 内生真菌的分离
• 2.2.4 菌种的鉴定
• 2.3 结果及讨论
• 2.3.1 菌株H1的形态学鉴定
• 2.3.2 菌株H2的形态学鉴定
• 第三章 北高丛越橘内生真菌生长曲线的测定
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌株H1的生长曲线
• 3.3.2 菌株H2的生长曲线
• 3.3.3 讨论
• 第四章 北高丛越橘内生真菌菌株H1的分子生物学鉴定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌株H1 DNA的提取
• 4.2.2 菌株H1 PCR扩增结果
• 4.2.3 菌株H1的PCR产物克隆结果
• 4.2.4 序列分析
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 北高丛越橘内生真菌菌株H2次级代谢产物的分离纯化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 主要仪器试剂
• 5.1.3 培养基
• 5.2 方法
• 5.2.1 培养基的制备
• 5.2.2 菌株H2的液体发酵培养
• 5.2.3 菌株H2菌丝体活性成分的初提
• 5.2.4 北高丛越橘叶片活性成分的初提
• 5.2.5 薄层层析法的探索
• 5.2.6 对提取物理化性质和化学结构的解析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 硅胶柱层析的分离结果
• 5.3.2 展开剂的确定及TLC检测结果
• 5.3.3 质谱、红外图谱和核磁共振谱鉴定结果
• 5.3.4 讨论
• 第六章 结论
• 6.1 北高丛越橘内生真菌的分离及形态学鉴定
• 6.2 北高丛越橘内生真菌菌株H1和H2生长曲线的测定
• 6.3 北高丛越橘内生真菌菌株H1的分子生物学鉴定
• 6.4 北高丛越橘内生真菌菌株H2次生代谢产物的分离纯化
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介