GSK3β抑制剂对糖尿病肾病大鼠肾组织TGF-β1和血清PAI-1表达的影响

论文摘要

研究背景：糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与多条细胞信号传导通路，其作用主要包括调节糖原的合成代谢、细胞的分化与增殖以及基因表达。我们发现2型糖尿病时肝脏及肌肉组织中GSK-3β活性异常升高，后者削弱了胰岛素信号的传导，使糖的利用、糖原合成等过程受抑制，从而出现胰岛素抵抗。因此，GSK-3β抑制剂可缓解胰岛素抵抗，用以治疗2型糖尿病。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要并发症之一，它以肾小球基底膜增厚、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）积聚、肾小管萎缩及间质纤维化为主要病理表现。国外有研究表明GSK-3β抑制剂氯化锂（Licl）可增加Akt、GSK-3β的磷酸化水平及核β-catenin的表达，进而减少高糖介导的肾小球系膜细胞凋亡、降低DN大鼠的蛋白尿。近年来，越来越多的研究表明糖尿病肾小管间质病变的严重程度与肾功能的进行性下降密切相关，然而GSK-3β活性与糖尿病肾小管间质病变的关系以及GSK-3β抑制剂对DN的影响及其机制尚不完全清楚。目的：本实验构建DN大鼠模型，并给予GSK-3β抑制剂Licl进行干预，通过观察后者对DN大鼠的蛋白尿、血糖、血肌酐、肾脏病理、肾组织TGF-β1表达及血清PAI-1水平的影响，从而明确GSK-3β抑制剂对DN的作用及其作用机制。方法：将60只雄性Wistar大鼠随机分为四组：正常对照组（NC组，n=10），Licl组（n=10），DN组（n=20），DN+Licl组（n=20）。通过一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）联合长期高脂饮食，建立DN大鼠模型；通过腹腔注射GSK-3β抑制剂Licl进行药物干预。观察各组大鼠一般状态、体重、肾重/体重的变化；检测血糖、尿量、尿蛋白、血肌酐等指标；肾脏PAS染色观察各组大鼠肾脏病理改变；用酶联免疫吸附实验（ELISA）方法检测各组大鼠血清纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activitor inhibitor-1，PAI-1）的水平，通过免疫组织化学（IHC）方法检测肾组织转化生长因子-β1（transforming growthfactorβ1，TGF-β1）的表达，进行组间比较。结果：与NC相比，DN组大鼠一般状态、体重、肾重/体重、血糖、血肌酐、尿量、尿蛋白均出现了DN特有的变化特征，且血清PAI-1明显增高（P＜0.05），肾组织TGF-β1的表达明显上调（P＜0.05）。肾脏病理结果显示：NC组基本正常，DN组表现为肾小球体积增大，弥漫性的肾小球系膜区增宽，细胞外基质弥漫增多，部分可见毛细血管基底膜增厚，肾小管上皮细胞弥漫性颗粒样变性，局灶空泡样变性，小管内可见蛋白管型，肾间质灶状炎细胞浸润。DN+Licl组较DN组大鼠存活率高，血糖、体重、肾重/体重无明显差别（P＞0.05），尿蛋白、血清PAI-1表达显著减少（P＜0.05），肾组织TGF-β1表达明显增加（P＜0.05）。DN+Licl组大鼠肾脏病理较DN组明显减轻，系膜区增宽及基质增多趋于好转，肾小管内蛋白管型明显减少，间质炎细胞浸润改善。Licl组与NC组相比，一般状态、体重、肾重/体重、血糖、尿量、尿蛋白、血肌酐、肾脏病理、血清PAI-1、肾组织TGF-β1表达均无明显变化（P＞0.05）。结论：1、GSK-3β抑制剂Licl能够降低DN大鼠的蛋白尿及死亡率。2、DN大鼠较正常大鼠血清PAI-1水平明显升高，GSK-3β抑制剂Licl能降低DN大鼠血清PAI-1的水平，从而降低PAI-1介导的肾脏ECM的过度积聚，改善肾脏凝血纤溶障碍。3、DN大鼠较正常大鼠肾组织TGF-β1表达明显上调，GSK-3β抑制剂Licl能进一步增加DN大鼠肾组织TGF-β1蛋白的表达，从而增加TGF-β1介导的肾小管上皮细胞向间充质转分化及肾间质纤维化。4、抑制GSK-3β，对治疗DN有积极的意义。但是GSK-3β抑制剂Licl作为药物治疗DN，应考虑其效应的两面性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 GSK-3β的结构与生物学功能
• 1.2 GSK-3β的作用机制
• 1.2.1 GSK-3β与 Wnt/β-catenin
• 1.2.2 GSK-3β与 PI3K/Akt
• 1.2.3 GSK-3β与糖原合成
• 1.2.4 GSK-3β与胰岛素信号通路
• 1.2.5 GSK-3β与 NF-κB 信号通路
• 1.3 GSK-3β抑制剂
• 1.3.1 锂离子
• 1.3.2 ATP 竞争性抑制剂
• 1.3.3 非 ATP 竞争选择性抑制剂
• 1.4 TGF-β1 与 DN
• 1.5 PAI-1 与 DN
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 药品和试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 动物分组
• 2.2.2 糖尿病肾病模型的构建
• 2.2.3 糖尿病肾病模型的验证
• 2.2.4 药物干预
• 2.3 大鼠标本采集
• 2.3.1 大鼠 24h 尿蛋白测定
• 2.3.2 大鼠外周血采集及肾组织称重
• 2.4 肾组织制片、PAS 染色和病理学观察
• 2.5 免疫组织化学方法检测肾组织 TGF-β1 的表达
• 2.6 ELISA 方法检测大鼠血清 PAI-1 的水平
• 2.7 统计学处理
• 第3章 结果
• 3.1 各组大鼠一般指标
• 3.1.1 一般状态分析
• 3.1.2 各组大鼠尿量、尿蛋白、血肌酐、血糖比较
• 3.1.3 各组大鼠体重、肾指数、肾小球面积比较：
• 3.2 各组大鼠肾脏病理变化
• 3.3 各组大鼠肾组织 TGF-β1 免疫组织化学
• 3.4 各组大鼠血清 PAI-1 的表达
• 第4章 讨论
• 4.1 GSK-3β抑制剂 Licl 对 DN 肾小管 EMT、肾间质纤维化的影响
• 4.2 GSK-3β抑制剂 Licl 对 DN 凝血纤溶状态的影响
• 4.3 GSK-3β抑制剂应用的利与弊
• 第5章 结论
• 参考文献
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果
• 致谢