苏云金芽胞杆菌S-层蛋白形成内涵体的研究

论文摘要

细菌S-层,或叫表面层（Surface layer）,简称S-layer,是古菌和真细菌最普通的表层结构,是由一种单分子的蛋白质亚单元组成的晶状二维排列。这种变化多样的最外层结构很好地反映了生物对特殊生态和环境条件的适应性。本文围绕苏云金芽胞杆菌（Bt）的S-层展开研究,主要结果如下:1、对前人的研究结论进行了补充,证明了Bt.CTC菌株的S-层基因不仅能在细胞表面表达形成典型的S-层结构,而且还可以在细胞内部累积形成内涵体;该内涵体蛋白编码基因与ctc2高度同源。2、CTC菌株芽胞期蛋白聚集体（或称“内涵体”）实际上并非传统的伴胞晶体,该蛋白聚集体也并不伴随着芽胞形成而形成,并证明该蛋白聚集体表面披被一层膜状结构。该内涵体在基因组成、表面和内部结构上与传统的伴胞晶体有显著的不同。在Bt.种中,还查明了由S-层蛋白形成内涵体的菌株占总数的22.6%。这些CTC-类似菌株一般不具有生物活性或仅有低生物活性。总之,在本室前人结论的基础上,提出了苏云金芽胞杆菌种中存在一类新的内涵体蛋白。此结论为Bt种内广泛存在的无毒菌株提供了一个新的研究思路。3、在前述结论上,发现CTC菌株内涵体的稳定表达及其降解与培养条件中的溶氧值有关,即与低氧条件有关。在发酵罐发酵条件下,应使其发酵溶氧浓度控制在2.0 mg/L。此时,经Western blot、RT-PCR和质谱测序表明,由S-层形成的内涵体蛋白为基因ctc2的表达产物。4、基于苏云金芽胞杆菌野生菌株接收外源质粒比较困难的事实,基本建立了一种基于电穿孔方法的基因转移方法,即在细菌培养过程中,适量加入一定浓度的甘氨酸/溶菌酶,采用SH缓冲液洗涤和悬浮菌体,供体质粒脱盐后,先电穿孔再进行42℃热冲击的方法,转化效率大大提高。5、通过双交换的方法对Bt.CTC菌株的S-层基因进行了成功缺失,继而对苏云金芽胞杆菌CTC菌株S-层的功能进行了初步探索,发现野生株可以耐受一定的碱性条件,从而证明S-层对于宿主的抗逆性有一定贡献。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1.文献综述
• 1.1 细菌S-层及其一般性质
• 1.2 细菌S-层的多样性
• 1.2.1 S-层结构的多样性
• 1.2.1.1 S-层在不同细菌种属中存在的多样性
• 1.2.1.2 不同的S-层致使表达形成不同的菌落形态
• 1.2.1.3 S-层结构装配的多样性
• 1.2.1.4 组成S-层晶格的结构多样性
• 1.2.1.5 S-层结构装配的牢固性存在多样性
• 1.2.2 S-层蛋白的多样性
• 1.2.2.1 S-层蛋白的大小呈现多样性
• 1.2.2.2 组成S-层的基本蛋白单元的多样性
• 1.2.2.3 形成S-层晶体的蛋白质结构单元同源性的多样性
• 1.2.2.4 S-层蛋白结构域的多样性
• 1.2.2.5 S-层蛋白转译后修饰的多样性
• 1.2.2.6 S-层蛋白作为抗原的多态性
• 1.2.3 S-层蛋白基因的多样性
• 1.2.3.1 编码S-层蛋白的基因多样性
• 1.2.3.2 S-层基因的结构多样性
• 1.2.3.3 S-层基因的启动子结构的多样性
• 1.2.4 细菌S-层的功能多样性
• 1.3 细菌S-层的应用
• 1.3.1 细菌S-层的应用概述
• 1.3.2 细菌S-层的应用基础
• 1.3.2.1 S-层蛋白的自装配
• 1.3.2.2 S-层蛋白与次细胞壁多聚体（SCWP）的相互作用
• 1.3.3 细菌S-层的应用实例
• 1.3.3.1 S-层融合蛋白和其应用
• 1.3.3.2 S-层蛋白在微米和纳米材料上的应用
• 1.4 蜡状芽胞杆菌群的S-层
• 1.4.1 蜡状芽胞杆菌群简介
• 1.4.2 蜡状芽胞杆菌群的S-层
• 1.5 细菌S-层研究方法综述
• 1.5.1 细菌S-层观测研究方法
• 1.5.2 细菌S-层基因在外源宿主中的表达
• 1.5.3 细菌S-层蛋白结构与功能的研究
• 1.6 本文的研究背景及研究意义
• 1.6.1 苏云金芽胞杆菌CTC菌株产生的伴胞晶体及其产生的条件
• 1.6.2 苏云金芽胞杆菌CTC菌株的S-层蛋白可以形成伴胞晶体
• 1.6.3 苏云金芽胞杆菌CTC菌株细胞表面的S-层结构
• 1.6.4 苏云金芽胞杆菌中S-层基因的普查
• 1.6.5 苏云金芽胞杆菌CTC菌株的分类鉴定
• 1.6.6 本文的研究目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 菌株
• 2.2 质粒
• 2.3 引物
• 2.4 培养基和实验试剂
• 2.4.1 培养基和普通实验试剂
• 2.4.2 生化试剂及免疫试剂
• 2.5 生物测定供试昆虫和靶细胞
• 2.6 DNA测序公司
• 2.7 仪器
• 2.8 各种溶液及配方
• 2.9 实验方法
• 2.9.1 微生物培养条件及菌种保藏
• 2.9.2 碱裂解法抽提大肠杆菌质粒DNA
• 2.9.3 大肠杆菌质粒DNA的少量快速提取及检测
• 2.9.4 苏云金芽胞杆菌总DNA抽提
• 2.9.5 DNA片段的回收
• 2.9.6 DNA的纯化
• 2.9.7 载体的去磷酸化
• 2.9.8 DNA的连接
• 2法）及转化'>2.9.9 大肠杆菌感受态的制备（CaCl₂法）及转化
• 2.9.10 苏云金芽胞杆菌的电穿孔
• 2.9.11 DNA的琼脂糖凝胶电泳
• 2.9.12 IPTG诱导大肠杆菌中重组基因的表达
• 2.9.13 PCR技术
• 2.9.14 AT克隆
• 2.9.15 苏云金芽胞杆菌RNA的抽提
• 2.9.16 RNA电泳（甲醛凝胶电泳）
• 2.9.17 RNA的定量以及质量检测
• 2.9.18 RT-PCR
• 2.9.19 SDS-PAGE和蛋白质的银染
• 2.9.20 Western blot
• 2.9.21 抗血清的制备
• 2.9.22 免疫双扩散定性检测抗体效价
• 2.9.23 ELISA定量检测抗体效价
• 2.9.24 蛋白质测序
• 2.9.25 蛋白质组学双向电泳分离技术
• 2.9.26 对棉铃虫毒力的生物测定和细胞毒性试验
• 2.9.27 分子生物学操作软件及基本生物信息学分析方法
• 3.结果与分析
• 3.1 与苏云金芽胞杆菌相关的生物信息学分析
• 1和ctc₂基因密码子组成分析'>3.1.1 ctc₁和ctc₂基因密码子组成分析
• 1和ctc₂基因内部重复序列分析'>3.1.2 ctc₁和ctc₂基因内部重复序列分析
• 1、ctc₂全基因重复序列分析'>3.1.3 ctc₁、ctc₂全基因重复序列分析
• 1和ctc₂基因上游启动子分析'>3.1.4 ctc₁和ctc₂基因上游启动子分析
• 1和ctc₂基因下游终止子分析'>3.1.5 ctc₁和ctc₂基因下游终止子分析
• 1基因的上游基因分析'>3.1.6 ctc₁基因的上游基因分析
• 1和ctc₂基因全长比对结果'>3.1.7 ctc₁和ctc₂基因全长比对结果
• 1和CTC₂蛋白全长比对结果'>3.1.8 CTC₁和CTC₂蛋白全长比对结果
• 1蛋白N段和CTC₂蛋白N段比对结果'>3.1.9 CTC₁蛋白N段和CTC₂蛋白N段比对结果
• 1蛋白C段和CTC₂蛋白C段比对结果'>3.1.10 CTC₁蛋白C段和CTC₂蛋白C段比对结果
• 1蛋白C段和CTC₂蛋白C段基因序列比对结果'>3.1.11 CTC₁蛋白C段和CTC₂蛋白C段基因序列比对结果
• 1和CTC₂蛋白保守结构域SLH分析'>3.1.12 CTC₁和CTC₂蛋白保守结构域SLH分析
• 3.1.13 S-层蛋白的信号肽预测
• 1蛋白和SAP蛋白比对结果'>3.1.14 CTC₁蛋白和SAP蛋白比对结果
• 2蛋白和EA1蛋白比对结果'>3.1.15 CTC₂蛋白和EA1蛋白比对结果
• 1-C和CTC₂-C末端多肽潜在的抗原决定簇分析'>3.1.16 CTC₁-C和CTC₂-C末端多肽潜在的抗原决定簇分析
• 3.1.17 小结
• 3.2 苏云金芽胞杆菌一类新的内涵体蛋白
• 3.2.1 CTC菌株在不同pH环境下的生长曲线
• 3.2.2 CTC菌株表面S-层的研究
• 3.2.2.1 CTC菌株表面S-层的电镜观察
• 3.2.2.2 CTC菌株表面S-层的冰冻蚀刻
• 3.2.2.3 SDS-PAGE检测CTC菌株表面S-层
• 3.2.2.4 CTC菌株表面S-层的初抽提
• 3.2.2.5 CTC菌株表面S-层蛋白测序结果
• 3.2.3 UTC菌株芽胞期内涵体的研究
• 3.2.3.1 CTC菌株芽胞期内涵体的电镜观察
• 3.2.3.2 CTC菌株芽胞期内涵体的初抽提
• 3.2.3.3 CTC菌株芽胞期内涵体蛋白测序结果
• 3.2.3.4 CTC菌株芽胞期内涵体的表面结构
• 3.2.5 Bt.菌株中类CTC菌株的普查
• 1和CTC₂蛋白C末端特异性抗血清的制备'>3.2.5.1 CTC₁和CTC₂蛋白C末端特异性抗血清的制备
• 3.2.5.2 62个Bt.菌株内涵体的SDS-PAGE和Western blot分析
• 3.2.5.3 62个Bt.菌株的PCR分析
• 3.2.5.4 阳性菌株的基因克隆、测序和序列比对分析
• 3.2.5.5 阳性菌株H20ac、T68、H61的基本生物学性状
• 3.2.6 内涵体蛋白对棉铃虫的毒力和细胞毒性
• 3.2.7 小 结
• 3.3 苏云金芽胞杆菌的S-层形成内涵体与低氧条件有关
• 3.3.1 CTC菌株在不同培养条件下的生长状态
• 3.3.1.1 在常规摇床中的发酵比较研究
• 3.3.1.2 在固体平皿中的生长比较
• 3.3.1.3 在发酵罐中的分批发酵比较研究
• 3.3.2 不同通气条件下S-层形成内涵体的Western blot证据
• 3.3.3 不同通气条件下S-层形成内涵体的RT-PCR证据
• 3.3.4 在低氧条件下S-层形成内涵体的质谱证据
• 3.3.5 低氧条件下其它菌株的S-层蛋白形成内涵体
• 3.3.6 小结
• 3.4 苏云金芽胞杆菌中S-层功能的初步探索
• 3.4.1 CTC菌株中S-层基因的突变结果
• 3.4.1.1 S-层基因突变菌株的中间载体的构建
• 3.4.1.2 苏云金芽胞杆菌野生菌株的电转化条件
• *的获得'>3.4.1.3 突变前的中间转化子BMB0549^*的获得
• *的PCR验证'>3.4.1.4 突变前的中间转化子BMB0549^*的PCR验证
• 3.4.1.5 通过双交换缺失CTC菌株的S-层基因示意图
• 1和ctc₂基因突变菌株的筛选结果'>3.4.1.6 ctc₁和ctc₂基因突变菌株的筛选结果
• 3.4.1.7 S-层基因突变菌株的验证
• 3.4.2 CTC菌株S-层缺失株耐碱性实验结果
• 3.4.3 通过蛋白质组学的方法研究S-层的功能
• 3.4.3.1 样品蛋白质浓度测定
• 3.4.3.2 突变株和野生株总蛋白的双向电泳
• 3.4.4 小结
• 3.5 本文主要结果总结
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻博期间的成果