层状结构生物相容微胶囊的制备及其药物传输性能

论文摘要

1991年，Decher等提出基于静电相互作用的层层自组装概念；1998年，M（o|¨）hwald等人将此技术应用于可去除的胶体颗粒，得到一种具有全新结构的微胶囊。本文通过层层自组装技术将聚电解质组装到胶体微粒上，去除胶体微粒模板后得到中空微胶囊，并探索了其在药物传输体系中的应用。首先利用无机沉淀法合成聚苯乙烯磺酸钠（PSS）掺杂的碳酸钙胶体微粒（CaCO3（PSS）），在其表面层层组装PSS和聚烯丙基胺盐酸盐（PAH）。用乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶去碳酸钙后，得到内部填充PSS的微胶囊。这种微胶囊对带正电荷的小分子药物、荧光探针和大分子多糖具有强烈的自沉积效应，而排斥带负电荷的分子。以PSS／PAH微胶囊为药物载体，研究了抗癌药物柔红霉素（DNR）和阿霉素（DOX）的药物投料浓度、离子强度和温度等条件对药物在微胶囊内沉积的影响。定量分析结果表明，在更高的药物初始浓度、更高的盐浓度下可将更多的药物包埋到微胶囊中（在药物投料浓度为1mg／mL时，DNR和DOX在微胶囊内的浓度分别达到29.6mg／mL和32.0mg／mL。）。由于微胶囊中预先包埋的PSS会释放出来，去核后在微胶囊表面额外组装聚电解质则导致药物包埋效率的降低。研究了不同层数的微胶囊对DNR和DOX的控释性能，药物自微胶囊中的释放在最初四小时内遵循扩散控制的释放机理。为制备生物相容性更好的微胶囊，采用天然多糖在碳酸钙微粒表面层层自组装，然后去核。碳酸钙模板的合成是在羧甲基纤维素钠（CMC）存在下通过硝酸钙与碳酸钠反应得到。通过热失重分析得出CMC在CaCO3（CMC）中的含量为5.3％。将两种生物相容性多糖壳聚糖和海藻酸钠依次组装在CaCO3（CMC）模板表面。Zeta-电位分析揭示了壳聚糖和海藻酸钠在碳酸钙表面的层层增长。将囊壁用戊二醛交联之后，微胶囊的稳定性显著提高。这样制备的壳聚糖／海藻酸钠微胶囊可自发包埋带正电荷的小分子物质如罗丹明6G。微胶囊的体外细胞培养显示出其具有良好的生物相容性。采用包埋DOX的微胶囊进行体外细胞培养和体内动物试验。完全由多糖制备的微胶囊通过在CMC掺杂的CaCO3微粒表面层层组装带相反电荷的壳聚糖和海藻酸钠，采用戊二醛交联囊壁，然后用EDTA去核。如此得到的微胶囊含有带负电的CMC，其在微胶囊中可能呈自由状态，或与第一层过量的壳聚糖形成络合物。这种微胶囊对带正电的DNR和DOX显示出强烈的富集效应，在药物投料浓度为1mg／mL时，两种药物在微胶囊内的浓度分别达到83.7mg/mL和88.6mg/mL。激光共聚焦显微镜（CLSM）和透射电镜（TEM）揭示了药物在微胶囊内均匀分布。被包埋的药物可以重新释放出来，并在起始阶段遵循扩散控制释放机理。采用包埋DOX的微胶囊进行动物试验，通过相差显微镜、CLSM和TEM等显微技术和吖啶橙、Hoechst33342和四氧化锇等染色方法证明载药微胶囊能够有效诱导HepG2肝癌细胞的凋亡。将HepG2肝癌细胞种植到BALB／c／nu裸鼠右前肢腋下产生肿瘤，采用载药微胶囊进行治疗。经4周体内培养，结果显示包埋的DOX（抑制率40.3％）比游离的DOX（抑制率30.6％）具有更好的治疗效果。本文进一步合成了两端带有氨基的PEG，以其作为间隔基，将叶酸接枝到聚电解质微胶囊表面，利用叶酸和细胞表面的叶酸受体的特异识别作用，实现叶酸修饰微胶囊对肝癌细胞的特异性黏附，并初步评价了叶酸修饰微胶囊包埋阿霉素后对人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 聚电解质微胶囊制备技术
• 1.2.1 层层自组装技术
• 1.2.2 聚电解质在胶体粒子表面的组装
• 1.2.3 模板
• 1.2.4 囊壁材料
• 1.3 微胶囊的基本物理性能
• 1.3.1 微胶囊的热稳定性能
• 1.3.2 微胶囊的电性能
• 1.3.3 微胶囊的渗透性能
• 1.3.3.1 离子强度对渗透性能的影响
• 1.3.3.2 膜厚对渗透性能的影响
• 1.3.3.3 pH值对渗透性能的影响
• 1.3.3.4 囊壁材料对渗透性能的影响
• 1.3.3.5 溶剂对渗透性能的影响
• 1.3.4 微胶囊的机械性能
• 1.3.4.1 外加渗透压
• 1.3.4.2 内部渗透压
• 1.3.4.3 原子力探针技术
• 1.3.4.4 退火对囊壁结构的影响
• 1.4 微胶囊对物质的包埋
• 1.4.1 在晶体表面进行LbL组装
• 1.4.2 内层分解包埋
• 1.4.3 囊内聚合
• 1.4.4 利用囊壁开关性质包埋
• 1.4.5 自沉积包埋
• 1.4.6 生物分子的包埋
• 1.5 课题的提出
• 第二章 抗癌药物在聚电解质微胶囊中的自发沉积与释放
• 2.1 实验部分
• 2.1.1 主要原材料和试剂
• 2.1.2 含PSS碳酸钙微粒的制备
• 3粒子内PSS含量的测定'>2.1.3 CaCO₃粒子内PSS含量的测定
• 2.1.4 聚电解质微胶囊的制备
• 2.1.5 DNR和DOX在微胶囊中的定量包埋
• 2.1.6 DNR和DOX自微胶囊中的释放
• 2.1.7 测试与表征
• 2.2 结果与讨论
• 3（PSS）微粒的制备'>2.2.1 CaCO₃（PSS）微粒的制备
• 2.2.2 水溶性物质在微胶囊中的自沉积包埋
• 2.2.3 药物在微胶囊中的定量包埋
• 2.2.4 DNR和DOX的释放
• 2.3 本章小结
• 第三章 壳聚糖/海藻酸钠层状微胶囊的制备及药物包埋释放
• 3.1 实验部分
• 3.1.1 主要原材料和试剂
• 3.1.2 含CMC碳酸钙微粒的制备
• 3（CMC）微粒上的层层自组装'>3.1.3 壳聚糖和海藻酸钠在CaCO₃（CMC）微粒上的层层自组装
• 3.1.4 戊二醛交联多层膜以及模板的去除
• 3.1.5 壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的细胞相容性评价
• 3.1.6 DNR和DOX在微胶囊中的定量包埋
• 3.1.7 DNR和DOX自微胶囊中的释放
• 3.1.8 载药微胶囊的体外抑制癌细胞生长实验
• 3.1.9 测试与表征
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 含CMC碳酸钙微粒的制备
• 3.2.2 壳聚糖/海藻酸钠层状微胶囊的制备
• 3.2.3 DNR和DOX在壳聚糖/海藻酸钠层状微胶囊中的自沉积
• 3.2.4 DNR和DOX在壳聚糖/海藻酸钠微胶囊中的定量包埋
• 3.2.5 DNR和DOX自微胶囊中的释放
• 3.2.6 载药微胶囊抑制癌细胞生长实验
• 3.3 本章小结
• 第四章 阿霉素和包埋阿霉素微胶囊的体内生物学评价
• 4.1 实验部分
• 4.1.1 主要原材料和试剂
• 4.1.2 主要实验设备
• 4.1.3 壳聚糖/海藻酸钠微胶囊的制备和药物的包埋
• 4.1.4 包埋阿霉素微胶囊诱导HepG2凋亡的形态学
• 4.1.4.1 HepG2的贴壁培养
• 4.1.4.2 游离阿霉素对HepG2增殖活性的影响—XTT法
• 4.1.4.3 HepG2细胞凋亡的形态学观察
• 4.1.4.4 包埋DOX微胶囊作用下HepG2的凋亡（吖啶橙染色）
• 4.1.4.5 包埋DOX的微胶囊作用下HepG2的凋亡（Hoechst 33342染色）
• 4.1.4.6 包埋DOX的微胶囊作用下HepG2的凋亡（TEM观测）
• 4.1.5 包埋DOX微胶囊对肝癌细胞HepG2裸鼠皮下移植瘤的药效学评价
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 DOX对HepG2增殖活性的影响——XTT法
• 4.2.2 包埋DOX微胶囊对人肝癌细胞HepG2诱导凋亡的形态学
• 4.2.3 DOX和包埋DOX微胶囊对HepG2细胞裸鼠皮下移植瘤抑制作用
• 4.3 本章小结
• 第五章 叶酸修饰的微胶囊对癌细胞的靶向识别作用
• 5.1 实验部分
• 5.1.1 主要原材料和试剂
• 5.1.2 碳酸钙微粒的制备
• 5.1.3 双端氨基PEG的合成
• 5.1.4 叶酸修饰聚电解质微胶囊的制备及抗癌药物包埋
• 5.1.5 叶酸标准曲线的绘制
• 5.1.6 叶酸修饰微胶囊与肝癌细胞的特异识别作用
• 5.1.7 包埋阿霉素的叶酸修饰微胶囊体外抑制HepG2细胞生长实验—CCK-8法
• 5.1.8 测试与表征
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 双端氨基PEG的合成
• 5.2.2 叶酸修饰聚电解质微胶囊的制备
• 5.2.3 叶酸修饰聚电解质微胶囊在肝癌细胞表面的特异性黏附
• 5.2.4 包埋阿霉素的叶酸修饰微胶囊对人肝癌细胞HepG2的生长抑制
• 5.3 本章小结
• 结论
• 建议与展望
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢