虫草真菌Fc-001产腺苷的研究

论文摘要

通过提取Fc-001菌株的基因组DNA,利用18S rRNA基因通用引物,进行扩增、转化感受态大肠杆菌,将阳性克隆测序,获得真菌Fc-001的18S rRNA基因序列,构建进化树,证实Fc-001菌株与冬虫夏草Cordyceps sinensis有99%的同源性。观察不同培养条件下真菌Fc-001菌株菌丝体形态和培养外观。固体培养条件下菌株Fc-001菌丝粗细均匀,细胞较小;气生菌丝发达,培养基背面菌丝生长部位玫瑰红色,培养7天时可见到菌落表面有小水珠形成。液体培养条件48h时,菌丝细胞细长,培养72h后,可见少量的无性孢子;采用麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘露醇葡萄糖和乳糖等不同碳源,在不同温度培养条件下,液体摇瓶培养的菌丝呈现黄、红两种不同的颜色。采用HPLC检测发酵菌丝中腺苷含量,确定检测条件:色谱柱Hypersil ODS反相柱,4.0mm×250mm,0.5μm,柱温度25℃,检测波长260nm,流动相0.01M KH2PO4:乙腈94:6。以真菌Fc-001菌丝体中腺苷含量和生物量为指标,进行液体摇瓶发酵,筛选最适的碳源、氮源,碳氮浓度、发酵周期、无机盐、装液量、接种量、pH值等,筛选最佳发酵条件。研究结果表明,最适摇瓶培养基组合为:早米粉4%,白糖1%,花生粉3%,生物素0.3%,KH2PO40.1%,MgSO40.05%,ZnSO4 10μg/L,pH 7.5,瓶装量为250mL三角瓶装量80mL,180rpm,24℃,培养时间8d。培养基组分优化以后,腺苷产量由2.89 mg/g增至4.52mg/g,Fc-001菌株菌丝体生物量由13.56g/L增至37.05g/L,两项指标提高均非常显着。在摇瓶发酵的基础上,进行50L发酵罐放大培养试验,发酵105h,腺苷含量可达3.26 mg/g。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 冬虫夏草研究概况
• 1.1.1 冬虫夏草的研究历史
• 1.1.2 冬虫夏草的生活史
• 1.1.3 冬虫夏草无性型的鉴定
• 1.2 冬虫夏草的化学成分研究
• 1.2.1 氨基酸类
• 1.2.2 多糖类
• 1.2.3 核苷类
• 1.2.4 糖醇、甾醇类
• 1.2.5 有机酸、烷烃、醇和少量的醛酚成分
• 1.2.6 其它主要成分
• 1.3 腺苷和虫草多糖药理作用、提取检测研究
• 1.3.1 腺苷的药理作用
• 1.3.1.1 在再灌注损伤中对各种器官的保护作用
• 1.3.1.2 抑制脂肪细胞生长
• 1.3.1.3 噪声保护中的作用
• 1.3.1.4 促进血管形成
• 1.3.1.5 腺苷对人输卵管活性的影响
• 1.3.1.6 对肿瘤细胞的作用
• 1.3.2 虫草多糖的药理作用
• 1.3.2.1 对肝脏的保护作用
• 1.3.2.2 降脂作用
• 1.3.2.3 降血糖作用
• 1.3.2.4 抗肿瘤作用
• 1.3.2.5 免疫调节作用
• 1.3.3 腺苷提取方法
• 1.3.4 腺苷检测方法
• 1.3.5 虫草多糖的提取检测
• 1.4 冬虫夏草的人工栽培与培养研究情况
• 1.4.1 人工栽培研究历史
• 1.4.2 成功栽培子实体需要具备的条件
• 1.4.3 人工栽培方法
• 1.4.4 液体培养
• 1.5 本研究的目的与意义
• 1.5.1 目的
• 1.5.2 意义
• 第2章 虫草Fc-001的18S rRNA基因序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 主要试剂
• 2.2.1.3 培养基及缓冲液
• 2.2.1.4 主要仪器
• 2.2.1.5 试剂与质粒
• 2.2.1.6 寡聚核苷酸引物
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 感受态Ecoli.JM 109制备
• 2.2.2.2 菌丝体总DNA的提取
• 2.2.2.3 真菌Fc-00118S rRNA基因的获得
• 2.2.2.4 PCR产物的回收
• 2.2.2.5 目的基因的连接
• 2.2.2.6 连接产物转化感受态细胞
• 2.2.2.7 阳性克隆子筛选
• 2.2.2.8 18S rRNA序列分析和进化树构建
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 18s rRNA基因的扩增反应
• 2.3.2 阳性克隆的检出
• 2.3.3 18S rRNA基因序列及系统进化树分析
• 2.3.4 系统进化树分析
• 2.4 小结
• 第3章 虫草真菌Fc-001的培养特征与形态观察
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 培养基
• 3.2.1.2 主要仪器
• 3.2.2 试验方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 菌丝体形态观察
• 3.3.2 培养物外观
• 3.4 小结
• 第4章 腺苷HPLC检测条件的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 主要试剂
• 4.2.1.2 主要仪器
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.2.1 菌丝体处理
• 4.2.2.2 检测条件的确定
• 4.2.2.3 腺苷标准曲线的绘制
• 4.2.2.4 精度试验
• 4.2.2.5 稳定性试验
• 4.2.2.6 回收率试验
• 4.2.2.7 菌丝中腺苷和虫草素的检测
• 4.3 试验结果与讨论
• 4.3.1 腺苷检测条件的试验
• 4.3.1.1 流动相的选择
• 4.3.1.2 流动相的配比试验
• 4.3.2 腺苷标准曲线的绘制
• 4.3.3 精度试验
• 4.3.4 稳定性试验
• 4.3.5 回收率试验
• 4.3.6 菌丝体中腺苷和虫草素的检测
• 4.4 小结
• 第5章 虫草真菌Fc-001的液体摇瓶发酵
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.1.1 培养基
• 5.2.1.2 药品与试剂
• 5.2.1.3 主要仪器设备
• 5.2.2 试验方法
• 5.2.2.1 菌种活化及摇瓶种子培养
• 5.2.2.2 碳源的选择
• 5.2.2.3 氮源的选择
• 5.2.2.4 碳源浓度选择
• 5.2.2.5 氮源浓度选择
• 5.2.2.6 金属离子的影响
• 5.2.2.7 发酵时间对腺苷含量和生物量的影响
• 5.2.2.8 pH的影响
• 5.2.2.9 装液量的影响
• 5.2.2.10 接种量试验
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 碳源的选择
• 5.3.2 氮源的选择
• 5.3.3 碳源浓度的选择
• 5.3.4 氮源浓度的选择
• 5.3.5 金属离子的影响
• 5.3.6 发酵周期试验
• 5.3.7 培养基最适pH试验
• 5.3.8 装液量试验
• 5.3.9 接种量试验
• 5.4 小结
• 第6章 50L发酵罐扩大试验
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.1.1 培养基
• 6.2.1.2 主要试剂
• 6.2.1.3 主要仪器
• 6.2.2 试验方法
• 6.2.2.1 菌种活化及种子培养
• 6.2.2.2 发酵条件
• 6.2.2.3 生化检测
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 葡萄糖标准曲线回归方程的建立
• 6.3.2 还原糖测定标准曲线
• 6.3.3 发酵液中总糖和还原糖的测定
• 6.3.4 发酵液pH的变化
• 6.3.5 生物量及菌丝体中腺苷含量的测定
• 6.4 小结
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历