免疫抑制剂Fk506对乳腺肿瘤细胞株的体外作用研究

论文摘要

本实验利用FK506 （Tacrolimus）,对乳腺肿瘤细胞系MCF-7进行体外作用研究,发现FK506可以抑制乳腺肿瘤细胞增殖;MTT结果显示,24 h与48 h的半抑制浓度基本一致,说明其在较短时间内即可发挥有效作用。细胞形态学观察以及细胞染色表明,FK506没有诱导细胞凋亡,而很可能是抑制了细胞的分裂。由于FK506的结合底物FKBP4（FK506 binding protein 4）是免疫亲和蛋白家族中的一员,主要作用是作为辅分子伴侣,与固醇类受体形成复合体,帮助其折叠,稳定以及转运;同时,它在细胞骨架的装配以及细胞分裂器定位调节中也发挥了重要作用,因此,FK506抑制乳腺肿瘤细胞增殖有可能与FKBP4的功能有关。此外,脚手架蛋白GIPC1（GIPC PDZ domain containing family, member 1）,作为乳腺肿瘤细胞的重要分子标记之一,是FKBP4一个潜在的相互作用蛋白。本实验室在先前的研究中发现,在乳腺肿瘤干细胞中,存在FKBP4与GIPC1共低表达现象,说明二者有可能存在功能相关性。还有实验表明,GIPC1与IGF1R结合,可以使之稳定,进而促进细胞增殖,抑制凋亡。因此,推测FK506是通过影响FKBP4与GIPC1相互作用,进而破坏IGF1R的稳定性而导致细胞增殖的抑制。然而免疫共沉淀实验未发现两者之间存在相互作用,蛋白印迹也未检测到IGF1R的含量与磷酸化状态在药物处理前后有明显变化。这虽未揭示FK506的作用机制,但也暗示,虽然在固醇类受体介导的信号转导中,需要FKBP4的积极参与,但在作为膜受体代表的IGF1R信号通路里,FKBP4却未呈现出相应的作用。这从另一方面说明,FKBP4作为辅分子伴侣对其底物选择具有一定的专一性,作用对象可能主要是位于核内的固醇类受体,而非膜受体。经双向电泳（2-DE）蛋白质表达图谱和MALDI-TOF-TOF质谱分析,发现有17个蛋白在FK506处理细胞前后表达量发生明显差异,并进一步从中鉴定出12个蛋白。根据功能将这些蛋白分为两大类:一类调节细胞骨架的装配与运输,从而影响神经发育与细胞分裂;另一类与基因存在密切的相互作用,参与了其复制,修复,转录调节以及翻译后蛋白的折叠,从而影响细胞分裂周期与凋亡。这些蛋白为我们明确FK506抑制细胞增殖的作用机制提供了基础。同时,FK506可以抑制乳腺肿瘤细胞增殖这一功能,也为其成为临床治癌药物提供了可能性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略表
• 第一章 绪论
• 1. 乳腺癌概述
• 1.1 乳腺癌疾病现状
• 1.2 乳腺癌的病因、诊断、治疗及生物学研究现状
• 2. Fk506
• 3. FKBP4 与GIPC1
• 3.1 FKBP4
• 3.2 GIPC1
• 3.2.1 Gipc1 与IGF1R 信号通路
• 3.3 假设
• 3.3.1 两个基本依据
• 3.3.2 提出假设
• 4. 蛋白质相互作用
• 4.1 蛋白质相互作用的意义
• 4.2 蛋白质相互作用的研究方法
• 4.3 免疫共沉淀技术
• 5. 蛋白质组学概述
• 5.1 蛋白质组和蛋白质组学概念
• 5.2 蛋白质组学主要技术
• 5.3 生物信息学技术
• 6 蛋白质组学与乳腺癌
• 7 本课题研究目的及意义
• 第二章 Fk506 对乳腺癌细胞增殖的影响
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料、试剂和仪器
• 2.1.1 细胞株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养和药物制备
• 2.2.2 MTT 试验测定细胞增殖情况
• 2.2.3 光学显微镜观察细胞形态变化
• 2.2.4 AO/EB 检测细胞凋亡
• 2.2.5 H33258 染色检测细胞凋亡
• 3. 结果
• 3.1 Fk506 对MCF-7 细胞增殖抑制作用
• 3.2 光学显微镜观察细胞形态变化
• 3.3 AO/EB 检测细胞凋亡
• 3.4 H33258 染色检测细胞凋亡
• 4. 讨论
• 第三章 FK506 对乳腺肿瘤细胞中GIPC1 与IGF1R 的稳定性影响
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料、试剂和仪器
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要溶液配制
• 2.1.3 主要材料
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品制备
• 2.2.1.1 免疫共沉淀样品制备
• 2.2.1.2 免疫印迹样品制备
• 2.2.2 免疫印迹（Western Blot）
• 3. 结果
• 3.1 免疫共沉淀结果
• 3.2 免疫印迹结果
• 4. 讨论
• 第四章 FK506 对乳腺肿瘤细胞的蛋白质组影响
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料、试剂和仪器
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要溶液配制
• 2.1.3 主要材料
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 分析软件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 样品制备
• 2.2.2 双向电泳
• 2.2.2.1 第一向等电聚焦（IEF）
• 2.2.2.2 IPG 胶条的平衡
• 2.2.2.3 IPG 胶条的转移和第二向SDS-PAGE
• 2.2.2.4 银染及图像分析
• 2.2.3 胶内酶解
• 2.2.4 MALDI-TOF-TOF 质谱鉴定和数据库搜索
• 3. 结果
• 3.1 药物作用前后的蛋白质组双向电泳图谱
• 3.2 双向电泳图谱的蛋白质表达差异
• 3.3 质谱鉴定结果
• 4. 讨论
• 第五章 结论和展望
• 1. 成果和结论
• 2. 展望
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况