自催化重组藻胆蛋白结构与功能的关系

论文摘要

藻胆蛋白是一类结构相似的色素蛋白。根据它们的吸收光谱,藻胆蛋白可分为藻蓝蛋白（phycocyanin,简称PC）、藻红蛋白（phycoerythrin,简称PE）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin,简称APC）,在某些没有藻红蛋白而具有异形胞的蓝藻中,还有藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin,简称PEC）。细菌光敏色素和别藻蓝蛋白都是能与PCB发生自催化重组的藻胆蛋白。细菌光敏色素AphA具有高效可逆光致变色性质,其分子量小,结构简单,在研究可逆光致变色的动态过程和设计光控分子器件等方面具有优势。为研究aphA的结构与功能的关系,利用分子生物学方法得到了缺失突变体AphA（26-320）,AphA（27-320）,AphA（28-320）,AphA（29-320）,AphA（32-320）,以此与色素PCB进行体外重组实验。结果表明,只有缺失突变体AphA（26-320）能与PCB进行自发的体外重组。这说明维系细菌光敏色素aphA与色素自催化连接的裂合酶结构域位于AphA（26-320）包含的肽链中,肽链N端的进一步缺失将导致裂合酶活性的丧失。本实验室研究推测:别藻蓝蛋白缺失突变体ApcE（1-240）中Cys-196是色素结合位点,ApcE（1-240）与CpcB,ApcB同源的结构域中的丝氨酸若突变为半胱氨酸也应具有与PCB发生自催化重组的功能。为了证实这两种推测,我们通过mega primer PCR构建了不含Cys的突变体apcE（1-240）（C196I） ,并在此基础上构建了突变体apcE（1-240）（C196I,S158C）。表达蛋白质ApcE（1-240）（C196I）和ApcE（1-240）（C196I, S158C）,通过其与PCB的重组反应,表明Cys-196确实是重组中的色素结合位点,而ApcE（1-240）与CpcB,ApcB同源的结构域中的丝氨酸若突变为半胱氨酸却不具有与PCB发生自催化重组的功能。为找到比ApcE（1-240）分子量更小、水溶性更好且同样具有与PCB发生自催化重组功能的蛋白。我们设计了缺失突变体ApcE（1-232）,ApcE（63-240）,ApcE（85-240）和ApcE（121-240）并表达了相应的蛋白。结果表明,这些缺失突变不仅没能改善其水溶性,而且造成其与PCB自催化重组功能的丧失。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 自催化重组藻胆蛋白
• 1.2 细菌光敏色素
• 1.3 藻胆体
• 1.4 藻胆蛋白
• 1.5 研究意义及展望
• 2 细菌光敏色素APHA 缺失突变体的自催化重组研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 光谱分析
• 2.5 讨论
• 3 APCE（1-240）半胱氨酸的定点突变及体外重组研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料和方法
• 3.3 APCE（1-240）（C1961）和APCE（1-240）（C1961,S158C）突变体基因的分子设计和构建
• 3.4 APCE（1-240）（C1961）和APCE（1-240）（C1961,S158C）突变体表达、纯化及SDS-PAGE 分析
• 3.5 包涵体蛋白的变性复性及体外重组
• 3.6 光谱测定
• 3.7 讨论
• 4 APCE（1-240）缺失突变体的自催化重组研究
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.3 APCE（1-240）突变体基因的分子设计和构建
• 4.4 突变体表达、纯化及SDS-PAGE 分析
• 4.5 包涵体蛋白的变性复性及体外重组
• 4.6 光谱测定
• 4.7 讨论
• 5 总结
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 附录2 缩略词（ABBREVIATION）
• 附录3 附图