论文摘要
目的1构建含TAT蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)与HO-1(血红素氧合酶-1,热休克蛋白32)融合基因片断的原核表达质粒TAT-HO-1-pET32a,表达、纯化TAT-HO-1-pET32a蛋白并鉴定其酶活、细胞毒性和体外/体内进入肝细胞的转导活性。2建立将TAT-HO-1-pET32a蛋白转导入体外培养的PLC细胞及SD大鼠肝脏细胞的蛋白质转导系统。3建立成年SD大鼠的肝脏部分再灌注损伤模型。4探讨TAT-HO-1-pET32a融合蛋白(血红素氧合酶-1,热休克蛋白32)对L-02细胞凋亡的保护作用。5探讨TAT-HO-1-pET32a融合蛋白对SD大鼠肝脏部分再灌注损伤的保护作用,以期为实现临床应用蛋白转导HO-1技术以减轻肝脏部分再灌注损伤而奠定基础。方法1采用PCR及克隆技术将HO-1编码区基因与TAT-PTD连接到原核表达载体pET32a上,通过酶切及测序鉴定表达载体TAT-HO-1-pET32a质粒是否正确。选取正确的TAT-HO-1-pET32a质粒转化E.coli BL-21,用IPTG诱导E.coli BL-21表达TAT-HO-1-pET32a融合蛋白,通过Ni-NTA-agarose纯化TAT-HO-1-pET32a融合蛋白,通过SDS-PAGE、Western-Blot鉴定融合蛋白。2测定TAT-HO-1-pET32a融合蛋白的酶活性,用CCK-8 kit检测TAT-HO-1-pET32a融合蛋白是否具有细胞毒性,通过将TAT-HO-1-pET32a融合蛋白加入体外培养的PLC细胞培养基中及自尾静脉注射入SD大鼠体内来检测TAT-HO-1-pET32a融合蛋白体外/体内进入细胞的转导活性。3体外培养L-02细胞实验分组一:(I)正常对照组(n = 4);(II)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h (n = 4);(III)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h(n = 4);(IV)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32(a100μg/mL)作用4h(n = 4)。通过CCK-8 kit检测TAT-HO-1-pET32a蛋白对细胞凋亡的保护作用。4体外培养L-02细胞实验分组二:(I)正常对照组(n = 4);(II)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h (n = 4);(III)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h(n = 4)。通过AO-PI检测TAT-HO-1-pET32a蛋白对L-02细胞凋亡的保护作用。5参照Nauta法建立成年SD大鼠的肝脏部分再灌注损伤模型;动物实验分组:(I)正常对照组(n = 6只) ,只行假手术,给予开腹及暴露左、中肝叶肝蒂处理,不阻断肝叶供血;(II)缺血再灌注损伤组(n = 6只) ,左、中肝叶缺血60min,再灌注6 h;(III)TAT-HO-1-pET32a组(n = 6只),缺血前自尾静脉注射TAT-HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h,左、中肝叶缺血60min,再灌注6 h;(IV)HO-1-pET32a蛋白组(n = 6只) ,缺血前自尾静脉注射HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h,左、中肝叶缺血60min,再灌注6h。各组动物分别通过肝上下腔静脉取血约2mL,并取肝脏标本,-80℃冻存留作检测用,后处死。6动物标本检测:分别检测血清ALT、AST及组织中SOD、MDA、MPO含量,缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞,光镜下肝组织病理形态学观察。结果1质粒TAT-HO-1-pET32a测序正确,融合蛋白TAT-HO-1-pET32a在E.coli BL-21中经IPTG诱导获得高效表达、并成功纯化,经Western-Blot定性鉴定为TAT-HO-1-pET32a蛋白,CCK-8 kit检测融合蛋白无细胞毒性,酶活检测融合蛋白的酶活性质稳定,可转导入在体外培养的PLC细胞和SD大鼠的肝细胞。2加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h可将用THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)处理24h的体外培养的L-02细胞的生存率从25.52%±0.47%提高到41.76%±5.49%,加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h可将L-02细胞的生存率从25.52%±0.47%提高到52.98%±6.29%。3与正常对照组相比再灌注损伤组、TAT-HO-1-pET32a组、HO-1-pET32a组的血清ALT、AST的水平显著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平显著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平显著增高(P<0.05)、髓过氧化物酶MPO水平显著增高(P<0.05),光镜下组织学观察肝组织损害明显严重。TAT-HO-1-pET32a组与再灌注损伤组相比血清ALT、AST的水平显著降低(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平显著增高(P<0.05)、丙二醛MDA水平显著降低(P<0.05)、髓过氧化物酶MPO水平显著降低(P<0.05);光镜下组织学观察肝组织损害明显减轻;凋亡指数为34.28%±3.00%,显著低于再灌注损伤组的56.12%±1.71% ( P < 0.05 )。HO-1-pET32a组与TAT-HO-1-pET32a组相比血清ALT、AST的水平显著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平显著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平显著增高(P<0.05)、髓过氧化物酶MPO水平显著增高(P<0.05);光镜下组织学观察肝组织损害明显加重;凋亡指数为56.96%±2.63% ,显著高于TAT-HO-1-pET32a组的34.28%±3.00%(P<0.05)。HO-1-pET32a组与再灌注损伤组相比血清ALT、AST的水平、超氧化物歧化酶SOD水平、丙二醛MDA水平、髓过氧化物酶MPO水平均无统计学差异(P >0.05);光镜下组织学观察肝组织损害程度较一致;凋亡指数为56.96%±2.63%,与再灌注损伤组的56.12%±1.71%相比无统计学差异(P >0.05)。结论1成功构建了原核表达载体TAT-HO-1-pET32a,得到了具有一定的酶活性、无细胞毒性并且可以体内体外转导入细胞的TAT-HO-1-pET32a蛋白,为进行TAT-HO-1-pET32a蛋白的进一步研究打下了基础。2成功建立了成年SD大鼠的肝脏部分再灌注损伤模型。3 TAT-HO-1-pET32a融合蛋白对THF-α+CHX诱导的L-02细胞的凋亡具有一定的保护作用。4 TAT-HO-1-pET32a融合蛋白能明显减轻SD大鼠的肝脏部分再灌注损伤。