系列逆转座子分子标记的建立及其在柿属植物中的应用研究

论文摘要

我国是柿属植物的分布中心和原产中心之一,拥有丰富的种质资源。逆转座子是真核生物基因组中的重要组成成分,其在决定植物基因组大小、结构、功能以及及其进化中扮演重要角色。开发和应用逆转座子分子标记,可为我国柿属植物种质资源研究提供技术支撑。本研究首先分离柿Tyl-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列并设计逆转座子引物,其次建立柿属植物IRAP、REMAP、SSAP和ISTR系列逆转座子分子标记技术体系并应用于柿属植物种质鉴定和亲缘关系分析等方面,同时应用非逆转座子分子标记AFLP和DAMD于柿属植物,并比较了二者以及ISTR与柿属特异性逆转座子分子标记在该属植物遗传分析中的性能,此外,对柿逆转座子引物在它类果树物种及禾本科、茄科和蔷薇科已发表的逆转座子引物在果树类作物上的通用性进行研究,并对一份特殊种质‘90-1-10’进行了鉴定。主要结果如下:1.利用抑制PCR方法从‘罗田甜柿’（Diospyros kaki Thunb.‘Luotiantianshi’）基因组中分离31条Tvl-copia类逆转座子的RNaseH-LTR序列,序列分析表明:至少有10个逆转座子家族得到扩增;其家族间序列普遍表现高度异质,发生不同程度的碱基替换、插入或缺失突变,以及翻译成氨基酸后的终止密码子突变、氨基酸取代和移框突变等;家族内部某些序列相似性极高,类反转录病毒中的准种居群;序列LTR区含有启动子的结构特征“CAAT box”、“TATA box”以及受不同胁迫条件作用下的调控元件。序列投递GenBank,登录号为EU068698-EU068728。2.基于其中15条RNaseH-LTR（Long terminal repeat）序列共设计26条逆转座子引物,包括8条正向LTR引物、10条反向LTR引物和8条PPT（polypurine tract）引物。为增加特异性,引物设计过程中充分考虑其较长长度和高Tm值:长度均在20bp～26bp之间,平均23bp;Tm值普遍高于55℃,平均为60.2℃。其中24条引物表现较好。3.优化PCR反应体系各组分浓度、退火温度（Tm）和扩增程序的基础上建立起适合柿属植物的逆转座子分子标记IRAP（Inter-retrotransposon amplifiedpolymorphism,逆转座子之间扩增多态性）和REMAP（Retrotransposon-miorosatelliteamplified polymorphism,逆转座子一微卫星扩增多态性）PCR扩增技术体系:20μL反应体系中,含1×Buffer、模板DNA 50 ng、Mg2+ 2.0mmol/L、dNTPs 0.25mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0U,矿物油20μL;PCR扩增程序:95℃5min;95℃1min;56℃1min ramp+0.6℃/s;72℃2min,循环44次;72℃延伸8min。4.建立柿属SSAP（Sequence-specific amplified polymorphism,特异序列扩增多态性）逆转座子分子标记技术体系,并对可能影响其扩增性能的几个重要因素和不同逆转座子在柿属种质遗传关系研究中的特点进行分析比较。结果表明,所有逆转座子都产生丰富的多态性,表明每个逆转座子都可单独用于SSAP分析;SSAP扩增性能与逆转座子自身的特点、选择性扩增酶接头引物的种类、组成及排序相关;不同逆转座子在28份试材中表现不同的转座特点。研究为进一步使用多逆转座子分子标记,以获得较为全面的柿属种质起源进化信息和进行遗传多样性评价及种质鉴定提供技术支持。5.建立适合柿属植物的通用引物逆转座子ISTR（Inverse sequenoe-tagged repeat,反向序列标签重复）分子标记体系,与IRAP同时用于32份柿属基因型的多态性和亲缘关系分析,并比较二者分析性能。结果表明,IRAP和ISTR均能很好的用于柿属植物的遗传分析;IRAP能区分供试所有基因型,包括芽变;ISTR不能区分‘富有’和其芽变‘松本早生’,但可以区分其它所有基因型;IRAP与ISTR的聚类结果基本一致,但在细节上存在差异;IRAP在种间及种下分析所得的所有参数值（平均每次实验扩增总位点数、平均每次实验扩增多态位点数、多态位点百分率Pi、多样性指数DI、有效多重系数EIVIR、标记指数Marker Index MI）均高于ISTR,总的来看,具有柿属特异性的IRAP标记系统的分析性能优于通用引物的ISTR。6.探讨IRAP用于柿属植物种间关系研究的可行性,并与小卫星分子标记DAMD（Directed amplification of minisatellite-region DNA,直接扩增小卫星DNA）进行多态性和聚类分析比较。结果表明IRAP可以很好的用于柿属种间亲缘关系研究;DAMD作为首次应用于柿属植物的标记类型,也表现出很好的扩增性能,并能区分芽变;IRAP和DAMD聚类基本均能将不同采集地的种按地理位置聚类,但对中国热带、亚热带采集的柿种与温带栽培柿之间的关系存在分歧;两种标记用于柿属植物种间亲缘关系研究,在多态性水平、平均扩增总位点等方面表现相当,然而综合扩增性能评价IRAP较优于DAMD。总的看来,IRAP是揭示柿属植物种间及种下丰富多态性的有效标记类型,而DAMD也是将来用作柿属植物遗传分析的极具潜力的标记类型。7.探讨IRAP用于品种内微小变异检测的性能,以我国最大的‘磨盘柿’产区—北京市房山区张坊镇上报的11株磨盘柿基因型作为试材,这些试材在成熟期、果实外观形态、抗性及耐贮性等方面性状与标准品种存在差异。结果表明,19个逆转座子单引物IRAP扩增中,4个引物（PPT3,PPT6,SAF5和SAR10）在磨盘柿变异间具多态性,采用二歧法,该4个引物可将11份‘磨盘柿’变异完全区分;UPGMA聚类图上,磨盘柿变异与标准磨盘柿紧密相聚,分支模式显著不同于种与种间及不同品种之间:相似系数计算表明,磨盘柿变异单株间的相似指数在0.90（‘MP2’与‘MP4’、‘MP8’、‘MP9’）～0.98（‘MP7’和‘MP8’）之间,平均0.94,与磨盘柿标准品种‘BZMP’的平均相似指数为0.91,大于种间和品种间相似水平,与芽变间的相似水平接近。总的看来,本研究鉴定了供试的11份北京房山区磨盘柿的变异为遗传物质的改变,并非饰变;11份基因型之间以及与标准磨盘柿品种在遗传上的高相似性表明,它们可能为磨盘柿的芽变类型;IRAP分子标记能够很好的区分遗传背景高度相似的微小变异,反映了该项技术是今后进行柿品种鉴定,尤其是遗传差异较为接近的基因型,如芽变的有效工具。8.IRAP、REMAP和SSAP逆转座子分子标记用于28份柿属植物种质鉴定,16个柿逆转座子引物在供试材料的单引物IRAP分析中检测到丰富的扩增位点,且高多态性比例（97.6%）;筛选出的7对REMAP引物和25对SSAP引物在相应的分子标记内同样检测到丰富的多态性（分别为95.2%和93.4%）;每一类型分子标记均可成功鉴定28份种质,其中2个IRAP引物（PPT3和SAR10）及4对SSAP引物（SAR10/EA06、SAR9/MC03、SAR9/MC11、SAR1/MC11）可以单独用于区分全部种质。进一步计算形态学相近和已知芽变关系的5组种质各组内基因型间的遗传距离,量化每种逆转座子分子标记的鉴别效率表明:IRAP为3种逆转座子分子标记中进行种质鉴别最为灵敏的标记类型。9.IRAP、REMAP、SSAP和AFLP（Amplified fragment length polymorphism,扩增限制性片段长度多态性）4种分子标记在柿属植物遗传关系研究中的应用效果比较表明:IRAP具有最高的多态性水平和多样性指数;AFLP的多态性低于IRAP和SSAP,但具有最高的标记指数;SSAP的标记指数值低于AFLP,但其多态性高于AFLP;4种分子标记的遗传相似系数矩阵间的相关性显著,相对而言REMAP可靠性略差;4种分子标记的聚类结果基本一致,均可将28份种质按种间及种下不同地理起源进行划分,然而聚类细节因标记种类不同有别。综合评述,IRAP适用于柿属植物遗传多样性分析和种质区分,尤其是遗传背景相近的种质鉴定,而SSAP和AFLP适用于起源、进化研究。10.从‘罗田甜柿’中开发的26个逆转座子引物在其它果树上的通用性试验表明:53.85%的引物可在供试果树类植物中获得扩增产物,但不同引物在不同物种中的通用性各异,其中在柿属、葡萄属、柑橘类和桃属植物中的通用性较好。利用可通用引物在柿属、柑橘类、葡萄属、桃属和梨属植物中的IRAP数据进行遗传关系分析的结果表明:这些引物在相关试材上还具有种质区分、亲子关系鉴定、分类和系统关系研究以及遗传多样性评价等研究的潜力;同时还研究了已发表的来自蔷薇科、禾本科和茄科的逆转座子引物在果树类作物上的通用性,进一步佐证了逆转座子引物可跨物种通用的特点,不同意前人的观点。11.我国原产柿种质中只有完全甜柿和完全涩柿两种类型,至今尚无不完全甜柿存在的报道。对引种自湖北省罗田县的‘90-1-10’进行形态学、细胞学鉴定及生化和分子水平分析,结果表明,‘90-1-10’具有与中国原产柿种质相近的果实特征,结合4种DNA分子标记IRAP、REMAP、SSAP和AFLP的聚类分析结果和引种地推断其属中国原产;可溶性单宁含量和单宁细胞大小的测定结果表明‘90-1-10’属非完全甜柿类型;果实脱涩和种子形成及其果肉褐斑情况分析结果表明‘90-1-10’应为非完全甜柿种质中的不完全甜柿:‘90-1-10’与‘罗田甜柿’及其它罗田甜柿变异单株在形态学、脱涩性状及DNA水平上表现明显的差异,表明其应为不同于‘罗田甜柿’的一份新种质。因此,‘90-1-10’可能系原产我国的不完全甜柿新种质。这是目前中国原产不完全甜柿类型的首例报道。

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摘要

Abstract

缩略语表

第一章课题的提出和前人研究进展

1.1 课题的提出

1.2 前人研究进展

1.2.1 柿属植物种质资源研究进展

1.2.1.1 柿属植物的种类和分布

1.2.1.2 柿的品种资源及分布

1.2.1.3 柿的原产地及起源植物

1.2.1.4 柿的品种分类

1.2.1.5 柿属植物的品种鉴定、分类和亲缘关系分析研究

1.2.1.5.1 依据形态特征进行柿品种鉴定、分类和亲缘关系等研究

1.2.1.5.2 利用细胞学标记进行柿品种分类和柿属植物系统进化研究

1.2.1.5.3 利用同工酶进行柿品种鉴定、分类和亲缘关系等研究

1.2.1.5.4 利用DNA分子标记进行柿属植物品种鉴定、分类和亲缘关系等研究

1.2.1.5.5 利用基因的DNA序列进行柿属植物系统进化等研究

1.2.2 植物逆转座子的研究进展

1.2.2.1 逆转座子的类型和结构

1.2.2.2 LTR逆转座子的复制与转座机制

1.2.2.3 逆转座子的起源

1.2.2.4 逆转座子的分布特点

1.2.2.5 逆转座子的纵、横向传递

1.2.2.6 逆转座子的高异质性

1.2.2.7 逆转座子的活性

1.2.2.8 逆转座子在植物基因组进化中的作用

1.2.2.8.1 逆转座子与植物基因组扩增

1.2.2.8.2 逆转座子与植物基因组重排

1.2.2.8.3 逆转座子与基因突变

1.2.2.8.4 逆转座子的生物多样性与生物进化

1.2.3 逆转座子分子标记及其在果树上的应用

1.2.3.1 逆转座子分子标记的类型、原理及特点

1.2.3.1.1 SSAP逆转座子分子标记

1.2.3.1.2 IRAP逆转座子分子标记

1.2.3.1.3 REMAP逆转座子分子标记

1.2.3.1.4 RBIP逆转座子分子标记

1.2.3.2 逆转座子引物的获得

1.2.3.2.1 逆转座子基因序列引物的获得

1.2.3.2.2 逆转座子其它序列引物的获得

1.2.3.3 逆转座子分子标记在果树上的应用

1.2.3.3.1 品种鉴定及基因组组成分析

1.2.3.3.2 遗传多样性及系统进化分析

1.2.3.3.3 遗传作图与QTL定位

1.2.3.4 问题与展望

1.2.4 芽变及芽变研究中的分子标记应用进展

1.2.4.1 芽变的概念及其在果树育种中的地位

1.2.4.2 芽变的特点及遗传学基础

1.2.4.3 芽变研究中的分子标记应用进展

1.3 本研究的目的和内容

1.3.1 研究目的

1.3.2 研究内容

1.3.3 技术路线

第二章柿Tyl-copia类逆转座子RNase H-LTR序列分离、分析及逆转座子引物开发

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 仪器及试剂耗材

2.2.2 试材

2.2.3 DNA提取

2.2.4 染色体步行法分离柿Tyl-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列

2.2.4.1 基因组DNA的酶切

2.2.4.2 接头准备

2.2.4.3 接头连接

2.2.4.4 抑制PCR第一轮扩增

2.2.4.5 抑制PCR第二轮扩增

2.2.4.6 电泳检测

2.2.4.7 PCR产物纯化

2.2.4.8 PCR产物连接

2.2.4.9 感受态细胞的制备

2.2.4.10 转化

2.2.4.11 质粒DNA提取

2.2.4.12 阳性克隆检测

2.2.4.13 测序、序列分析和引物设计

2.2.4.14 序列提交

2.3 结果与分析

2.3.1 RNase H-LTR序列的PCR扩增及克隆测序

2.3.2 Tyl-copia类逆转座子RNaseH 3'端氨基酸序列特性分析

2.3.3 Tyl-copia类逆转座子PPT和末端倒转重复序列（IR）的特性分析

2.3.4 RNaseH-LTR序列的同源性及聚类分析

2.3.5 LTR序列中的启动子结构预测

2.3.6 逆转座子引物设计

2.4 讨论

2.4.1 利用RNaseH基因保守结构域分离柿Tyl-copia类逆转座子RNaseH-LTR序列的可行性

2.4.2 利用抑制PCR方法开发柿逆转座子引物的有效性

2.4.3 引物的有用性

2.4.4 柿逆转座子的高异质性

2.4.5 Tyl-copia类逆转座子LTR内的启动子结构与调控元件

第三章柿属植物IRAP和REMAP逆转座子分子标记技术体系的建立及其磨盘柿变异单株的IRAP分析

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1 材料

3.2.2 DNA提取

3.2.3 IRAP反应体系优化

3.2.4 IRAP分析

3.2.5 REMAP反应体系建立

3.2.6 产物电泳检测

3.2.7 数据分析

3.3 结果与分析

3.3.1 不同DNA模板浓度对IRAP反应的影响

2+浓度对IRAP反应的影响'>3.3.2 不同Mg²⁺浓度对IRAP反应的影响

3.3.3 不同dNTPs浓度对IRAP反应的影响

3.3.4 不同引物浓度对IRAP反应的影响

3.3.5 不同Taq聚合酶浓度对IRAP反应的影响

3.3.6 不同退火温度对IRAP反应的影响

3.3.7 IRAP反应体系的确立

3.3.8 IRAP分析结果

3.3.9 REMAP分子标记体系的确立

3.3.10 磨盘柿变异单株的IRAP分析

3.3.10.1 IRAP多态性分析

3.3.10.2 IRAP相似指数计算

3.3.10.3 IRAP聚类分析

3.4 讨论

3.4.1 IRAP反应体系的优化

3.4.2 IRAP扩增的多态性

3.4.3 IRAP对磨盘柿变异的鉴定

第四章柿属植物SSAP逆转座子分子标记技术体系的建立及其在遗传分析中的应用

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.2.1 试材

4.2.2 DNA提取

4.2.3 SSAP分析

4.2.3.1 基因组DNA酶切

4.2.3.2 接头准备

4.2.3.3 连接反应

4.2.3.4 预扩增反应

4.2.3.5 选择性扩增反应

4.2.3.6 选择性扩增产物电泳检测

4.2.3.6.1 玻璃板的准备

4.2.3.6.2 制胶

4.2.3.6.3 预电泳

4.2.3.6.4 正式电泳

4.2.3.6.5 银染

4.2.4 数据统计

4.3 结果与分析

4.3.1 SSAP引物筛选及琼脂糖检测

4.3.2 逆转座子引物对SSAP扩增的影响

4.3.3 接头引物末端选择性碱基的组成及排序对SSAP扩增的影响

4.3.4 内切酶引物类别对SSAP扩增的影响

4.3.5 SSAP在柿属植物遗传分析中的应用

4.3.5.1 SSAP多态性分析

4.3.5.2 SSAP相似指数及聚类分析

4.3.5.3 高信息量SSAP引物组合的鉴定

4.3.5.4 基于不同逆转座子的SSAP分子标记应用于28份试材遗传分析的比较研究

4.4 讨论

4.4.1 SSAP体系建立需注意的问题

4.4.2 SSAP扩增的影响因素

4.4.3 SSAP分子标记的多态性

4.4.4 基于不同逆转座子因子的SSAP分子标记分析的特点

4.4.5 SSAP分子标记的聚类分析结果

第五章部分柿属植物亲缘关系的IRAP和ISTR分析

5.1 前言

5.2 材料和方法

5.2.1 材料

5.2.2 DNA提取

5.2.3 IRAP分析

5.2.4 ISTR分析

5.2.4.1 ISTR体系优化

5.2.4.1.1 ISTR扩增所选用引物序列

5.2.4.1.2 ISTR-PCR反应参数的设置

5.2.4.2 利用优化后的ISTR体系进行32份柿属基因型的正式分析

5.2.5 产物电泳检测

5.2.6 数据分析

5.3 结果与分析

5.3.1 柿属植物ISTR反应体系的建立

2+浓度'>5.3.1.1 Mg²⁺浓度

5.3.1.2 dNTP浓度

5.3.1.3 引物浓度

5.3.1.4 Taq酶浓度

5.3.1.5 DNA酶浓度

5.3.1.6 ISTR反应体系的确立

5.3.2 IRAP的多态性、相似指数、UPGMA聚类分析

5.3.3 ISTR的多态性、相似指数及UPGMA聚类分析

5.3.4 IRAP和ISTR在柿属植物亲缘关系分析中的比较研究

5.3.4.1 IRAP和ISTR多态性水平（Pi）、多样性指数（DI）、有效多重系数（EMR）及标记指数（MI）比较

5.3.4.2 IRAP和ISTR两种分子标记揭示的遗传相似性及相关性比较

5.3.4.3 IRAP和ISTR分子标记聚类结果比较

5.4 讨论

5.4.1 IRAP分子标记的多态性

5.4.2 柿属植物ISTR反应体系的优化

5.4.3 ISTR分子标记及多态性

5.4.4 IRAP和ISTR分子标记比较

5.4.5 基于IRAP和ISTR数据的柿属植物间的遗传关系

第六章柿属植物种间亲缘关系的IRAP和DAMD分析

6.1 前言

6.2 材料和方法

6.2.1 材料

6.2.2 DNA提取

6.2.3 IRAP分析

6.2.4 DAMD分析

6.2.5 产物电泳检测

6.2.6 数据分析

6.3 结果与分析

6.3.1 IPAP多态性、相似指数及UPGMA聚类分析

6.3.2 DAMD多态性、相似指数及UPGMA聚类分析

6.3.3 IRAP和ISTR在柿属植物亲缘关系分析中的比较研究

6.3.3.1 IRAP和ISTR多态性水平（Pi）、多样性指数（DI）、有效多重系数（EMR）及标记指数（MI）比较

6.3.3.2 IRAP和DAMD两种分子标记揭示的遗传相似性及相关性比较

6.3.3.3 IRAP和DAMD分子标记聚类结果比较

6.4 讨论

6.4.1 IRAP标记在柿属植物种间和种下的多态性

6.4.2 IRAP揭示的部分柿属植物的分类学地位

6.4.3 DAMD分子标记及其多态性

6.4.4 DAMD分子标记揭示的部分柿属植物的分类学地位

6.4.5 IRAP和DAMD分子标记比较

6.4.6 美洲柿的分类学地位

第七章 IRAP、REMAP和SSAP逆转座子分子标记在柿属植物遗传分析中的应用

7.1 前言

7.2 材料和方法

7.2.1 试材

7.2.2 DNA提取

7.2.3 IRAP和REMAP分析

7.2.4 SSAP分析

7.2.5 AFLP分析

7.2.6 谱带统计及数据分析

7.3 结果与分析

7.3.1 IRAP、REMAP、SSAP用于柿属植物种质鉴定

7.3.1.1 IRAP、REMAP、SSAP多态性

7.3.1.2 IRAP、REMAP、SSAP用于柿属植物种质鉴定

7.3.2 AFLP多态性

7.3.3 SSAP和AFLP相似系数比较

7.3.4 IRAP、REMAP、SSAP、AFLP4种分子标记比较

7.3.4.1 4种分子标记多态性水平（Pi）、多样性指数（DI）、有效多重系数（EMR）及标记指数（MI）比较

7.3.4.2 4种分子标记揭示的遗传相似性及相关性比较

7.3.4.3 4种分子标记聚类结果比较

7.4 讨论

7.4.1 IRAP、REMAP和SSAP逆转座子进行种质鉴定

7.4.2 SSAP和AFLP遗传相似系数比较

7.4.3 IRAP、REMAP、SSAP、AFLP 4种分子标记比较

第八章逆转座子引物的通用性研究

8.1 前言

8.2 材料和方法

8.2.1 试材

8.2.2 样品总DNA提取

8.2.2.1 柿属植物、柑橘类、葡萄、枇杷、枣、板栗、石榴、银杏、猕猴桃DNA提取

8.2.2.2 桃、李、杏、樱桃DNA提取

8.2.2.3 苹果、梨、山楂DNA提取

8.2.3 样品总DNA质量检测及备用

8.2.4 逆转座子引物来源

8.2.4.1 柿逆转座子通用性检测引物来源

8.2.4.2 它物种逆转座子引物通用性检测引物来源

8.2.5 通用性检测

8.2.6 数据统计及分析

8.3 结果与分析

8.3.1 样品总DNA质量检测

8.3.2 柿逆转座子引物在果树类物种的通用性

8.3.2.1 罗田甜柿逆转座子引物在柿属植物种间、种下及其它果树物种上的通用性

8.3.2.2 罗田甜柿逆转座子引物在柿属、柑橘类、葡萄属、桃属和梨属植物中的IRAP多态性分析

8.3.2.3 罗田甜柿逆转座子引物在柿属、柑橘类、葡萄属、桃属和梨属植物中的亲缘关系分析

8.3.3 它物种逆转座子引物在果树类作物的通用性

8.3.3.1 它物种逆转座子引物在柿属植物的通用性研究

8.3.3.2 它物种逆转座子引物在果树类作物的通用性研究

8.4 讨论

8.4.1 样品总DNA提取方案的筛选

8.4.2 柿逆转座子引物在其它果树类中的通用性

8.4.3 它物种逆转座子引物在其它果树类中的通用性

第九章大别山区新发现的不完全甜柿类型的鉴定及其与‘罗田甜柿'的亲缘关系研究

9.1 前言

9.2 材料和方法

9.2.1 试材

9.2.2 树及果实形态学观察

9.2.3 单宁细胞大小及可溶性单宁含量测定

9.2.4 分子标记分析

9.2.5 分子标记数据统计及分析

9.3 结果与分析

9.3.1 树体形态观察

9.3.2 果实形态观察和可溶性单宁含量

9.3.3 单宁细胞形态观察及大小测定

9.3.4 分子标记分析

9.4 讨论

9.4.1 ‘90-1-10'树型、果实形态及可溶性单宁含量分析

9.4.2 ‘90-1-10'分子标记分析

第十章总结论及讨论

10.1 逆转座子引物开发、转用及逆转座子分子标记开发

10.2 不同分子标记方法及聚类分析结果的比较

10.3 不完全甜柿的发现及其在甜柿起源进化中的作用

10.4 ‘金枣柿'的分类学地位

10.5 本研究的创新点

10.6 进一步工作设想

参考文献

致谢

附录

攻读博士学位期间发表论文

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