论文摘要
膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，90％以上为移行细胞癌。初次就诊的患者中70％～80％为浅表性膀胱癌，其中70％为Ta期，30％为T1期，不论肿瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌层。经尿道切除术或者膀胱部分切除术可以切除原发肿瘤，但由于膀胱癌的多中心性和多发性特点，术后5年复发率高达三分之二，而术后15年的复发率则高达88％，复发的患者中约有15％会进展为浸润性膀胱癌。因此，浅表性膀胱癌手术后如何预防复发和疾病进展是泌尿外科医生共同努力的目标。自上个世纪60年代起开始的膀胱内灌注治疗有效地延缓或者阻止了肿瘤的复发和进展，因此，膀胱灌注治疗己成为膀胱癌治疗的重要手段之一。目前膀胱灌注治疗的药物主要为两大类，分别为化学药物和免疫制剂，其中喜树碱类衍生物是膀胱灌注化疗的重要药物之一。喜树碱类衍生物的构效关系分析表明在7，9，10位被基团取代的喜树碱类衍生物具有很强的抗肿瘤活性。尽管在10位被羟基和烷基取代后，如10-甲氧基喜树碱有一定的抗肿瘤活性，但是其有较强的毒副作用限制了它的临床应用。相反在9位引入硝基，如9-硝基喜树碱，不仅能保证其治疗效果，同时还具有较低的毒副作用。但要将喜树碱硝化得到9-硝基喜树碱是比较困难的，因为12-硝基喜树碱会是最主要的产物。而对10—羟基喜树碱进行硝化则容易得到10—甲氧基—9—硝基喜树碱（MONCPT），国内华东师范大学合成了该化合物。该药系我国有自主知识产权的喜树碱类抗肿瘤新药，目前正在进行临床前研究。膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤，本课题就是考察MONCPT对膀胱癌细胞增殖的抑制作用并对其作用机制进行研究。目的：1、研究MONCPT对膀胱癌5637细胞增殖的抑制作用（在体和离体）；2、考察MONCPT对膀胱癌5637细胞周期的影响，若有影响则进一步探讨其作用机制；方法：1)采用MTT法，评价MONCPT体外抑制膀胱癌5637细胞活性；2)采用裸小鼠皮下移植瘤模型，观察MONCPT对荷人膀胱癌5637裸小鼠的实验治疗作用；3)应用流式细胞术检测不同浓度MONCPT和MONCPT在不同作用时间对5637细胞周期的影响；4)采用Western blotting的方法检测MONCPT对5637细胞p53，CDK7，p21，AKT，Mat1，Wee1，Cyclin B1，CDK1，Cyclin H，Cdc25C等蛋白表达水平的影响；结果：1、MONCPT对人膀胱癌细胞株的体外抑制作用：采用MTT法对人膀胱癌5637细胞进行体外IC50测定，结果表明，MONCPT对人膀胱癌5637细胞作用48小时有较强的抑制增殖作用，IC50值为1．31±0．16μM。结果还显示，随浓度的下降，MONCPT在体外对人膀胱癌5637细胞的抑制率迅速降低，呈明显的剂量依赖关系。2、MONCPT对人膀胱癌5637细胞的实验治疗作用：对裸小鼠体内5637肿瘤的实验治疗作用试验结果显示，MONCPT 5、10和20mg／kg组裸小鼠体重无明显影响（P>0．05）。与相应的溶剂对照组比较，Irinotican10mg／kg和MONCPT 10mg／kg组移植瘤体积从第5天开始显著减小（P<0．05—0．01），而MONCPT 20mg／kg组植瘤体积从第3天开始显著减小（P<0．05），MONCPT 5mg／kg组植瘤体积从第9天开始显著减小（P<0．01）。MONCPT 5mg／kg组在给药后第3、5、7、9、11、13和15天的相对肿瘤增殖率（T／C，％）分别为103．2％、84．6％、95．7％、80．2％、62．0％、41．6％和23．8％，从第13天开始相对肿瘤增殖率小于60％；MONCPT 10mg／kg组相应的相对肿瘤增殖率分别为95．3％、67．7％、61．4％、34．2％、21．2％、11．1％和6．2％，从给药后第9天开始相对肿瘤增殖率小于60％；MONCPT 20mg／kg组相应的相对肿瘤增殖率分别为73．2％、51．9％、40．3％、20．9％、11．7％、6．9％和3．3％，从给药后第5天开始相对肿瘤增殖率小于60％；Irinotican 10．0mg／kg组相应的相对肿瘤增殖率分别为88．1％、70．4％、50．5％、31．3％、20．8％、13．8％和7．3％，从给药后第7天开始相对肿瘤增殖率小于60％。给药15天后剖杀裸小鼠取瘤块称重发现，MONCPT 5mg／kg、10mg／kg和20mg／kg组的人膀胱癌5637移植瘤平均重量分别为0．63±0．12g、0．24±0．06g和0．06±0．03g，与阴性对照组的1．83±0．30g比较均有明显下降（P<0．01），三个剂量组相应的肿瘤抑制率分别为64．8％、86．2％和96．5％，肿瘤抑制率均大于40％。Irinotican 10．0mg／kg组的平均瘤重为0．36±0．09g，与溶剂对照组比较也有显著下降（P<0．01），抑瘤率为81．1％，大于40％。3、MONCPT诱导人膀胱癌5637细胞周期阻滞作用：MONCPT10，1，0．1，0．01μM分别对人膀胱癌5637细胞作用24小时后，DNA分析结果表明，溶剂对照组的G2／M期的肿瘤细胞百分率分别为8．56±2．13％；而MONCPT10，1，0．1，0．01μM处理24小时后，处于G2／M期肿瘤细胞百分率分别为19．7±3．6％、46．9±7．3％、76．8±9.2％和18．55±3．5％，0．1μM的MONCPT能达到最大的肿瘤细胞周期阻滞作用。用0．1μM的MONCPT处理5637细胞12h，24h，36h和48h，并设溶剂对照，收集各组细胞，用流式细胞术检测细胞的周期阻滞率。结果显示，溶剂对照组的G2／M期的肿瘤细胞百分率为11．45±2．3％，随着MONCPT作用时间的延长，G2／M期比率分别为22．4±3.85％（12h）、79．18±7．3％（24h）、50．15±6．25％（36h）和29．7±3.85％（48h）。4、MONCPT对5637细胞周期相关蛋白表达量的影响：用0．1μM MONCPT分别处理5637细胞12，24，36和48h，并设对照，收集各组细胞，提取蛋白，用Western印迹法检测CDK1、CyclinB1、Cyclin H、MAT1、AKT、Wee1、CDK7，Cdc25C，p21和p53蛋白表达量的变化。结果显示，随给药时间的延长，MONCPT可使人膀胱癌5637细胞p53，p21的表达先增加后下降，MAT1、CyclinB1的表达先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1的表达量下降。讨论和结论：MONCPT是新合成的喜树碱类衍生物。体内外的抗肿瘤实验证实MONCPT对人膀胱癌5637细胞具有很强的抑制增殖作用，同时我们还证实这种作用是可以通过对细胞周期G2／M期阻滞实现的。近几年来，植物来源的抗肿瘤药物受到了广泛的关注。当哺乳动物细胞遇到DNA损伤时，细胞周期会停滞直到错误被纠正，细胞周期G2／M期被阻滞后细胞将停滞生长。相比较G1／S，人们对G2／M了解的并不多，然而这个周期检验点对于肿瘤发生却是非常重要的。G2／M的转变是受到Cdc家族蛋白和cyclin调控的，Cdc2可以被四个转录靶点p53，Gadd45，p21和14—3—3σ所抑制。p53可作为转录因子，诱导另外几种蛋白的产生，如p21，从而达到调控细胞周期的作用。在哺乳动物细胞中，cyclin的结合和CAK对Cdc2的Thr161位磷酸化对于Cdc2-cyclin B复合物的活性都是非常重要的。若没有Cdc25C对Cdc2的Thr14和Tyr15位去磷酸化，且Plk1磷酸化cyclin B时，细胞周期将被停滞。当用0．1μM MONCPT分别处理5637细胞12，24，36和48h，Western印迹法检测结果显示，随给药时间的延长，5637细胞的p53，p21表达先增加后下降，MAT1、CyclinB1表达先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1表达量下降。因此，我们推测，MONCPT使人膀胱癌5637细胞终止在G2／M期的作用可能是其通过诱导细胞p53、p21表达上调和CyclinB1、CDK1、CDK7、AKT、Wee1、Cyclin H、Mat1和Cdc25C表达下调，从而使细胞终止在G2／M期，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。综上所述，我们实验证实，MONCPT对人膀胱癌5637细胞的增殖具有明显的抑制作用，其作用机制可能与p53通路、CDK7、Cdc25C及cyclin B1-CDK1复合物有密切关系，通过阻滞膀胱癌细胞周期而发挥抗肿瘤活性。在体和离体实验证实，MONCPT具有良好的抗膀胱癌实验治疗作用，值得在临床进一步实验以确证疗效。
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标签：膀胱癌论文; 细胞周期论文; 甲氧基硝基喜树碱论文; 抗肿瘤活性论文;