广西高致病性猪繁殖与呼吸综合征的流行病学调查及其病毒ORF5、ORF6、ORF7基因的克隆与序列分析

论文摘要

本研究通过对广西百色、河池、玉林、南宁、贺州、贵港、崇左、防城港、柳州、北海、钦州、桂林等12个地市的38个发生疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征的猪场进行流行病学调查、症状和病变观察,采集病猪的血清、肺、脾、淋巴结等病料用RT-PCR方法进行检测,共检测到104份PRRSV阳性病料。调查发现,高致病性PRRS在广西的流行范围广,传播速度快,发病率高,症状和病变典型;母猪发病后的流产率近100%;哺乳仔猪和保育猪的发病率达100%,死亡率高达60%-100%;生长猪、育肥猪发病后的死亡率相对较低。通过对其中的18个PRRS毒株分别进行ORF5、ORF6、ORF7基因的克隆和测序,结果发现,18个毒株之间,其ORF5、ORF6、ORF7基因的核苷酸同源性分别为97.7-100%、98.3-100%、98.4-100%,氨基酸同源性分别为97.0-99.5%、97.1-99.4%、95.2-99.2%,彼此同源性很高;与美洲型标准毒株VR-2332株相比,其核苷酸的同源性分别为88.4-89.7%、94.3-95.4%、93.5-94.4%,氨基酸同源性分别为87.1-88.6%、94.9-97.1%、90.3-96.0%;与欧洲型代表毒株LV株的核苷酸同源性分别为63.2-64.6%、68.2-69.0%、65.1-65.9%,氨基酸同源性分别为57.5-58.0%、77.1-78.9%、55.6-58.9%,由此说明这18个流行毒株均属于美洲型毒株;而与2006年前的6个广西流行毒株相比,其氨基酸同源性分别为86.1-96.0%、93.1-96.6%、88.7-97.6%。从E蛋白的变异来看,本次获得的毒株与时间间隔最长的亚群Ⅰ的2002年广西分离株GXA核苷酸同源性为88.4-89.6%,氨基酸同源性为86.1-87.6%;与亚群Ⅱ的GXWX毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.1-90.5%和88.6-90.5%,但与JXA1、HUB2、HEB1、HuN株的核苷酸和氨基酸的同源性很高,分别高达98.5-99.7%、97.5-99.5%。这说明广西2006年后流行的PRRSV较以前的毒株有了较大程度的变异,并与高致病性的JXA1、HUB2、HEB1、HuN株的同源性非常高。与国内外的PRRS毒株比较,在推导编码的氨基酸序列中,本研究的18个毒株的E蛋白氨基酸的变异主要集中在24-39aa、58-66aa、92-104aa、161-164aa、185-200aa;M蛋白的氨基酸变异主要发生在10aa,63-70aa,N蛋白的氨基酸变异主要集中在46aa、91aa、109aa及117aa位点。通过遗传进化树分析,18个广西PRRS流行毒株与CH-1a株同属于亚群Ⅱ,并与国内流行的高致病性PRRS变异毒株JXA1、HUB2、、HEB1、HuN株亲缘关系较近,同处于一个小分支,可能来源于同一个毒株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 1、病原学
• 2、流行病学
• 3、临床症状
• 4、病理变化
• 5、诊断
• 6、PRRSV的免疫
• 7、防制措施
• 8、本研究的目的和意义
• 第一章 材料与方法
• 1.1 流行病学调查
• 1.2 临床症状、病理变化观察
• 1.3 病料采集
• 1.4 分子生物学试剂
• 1.5 载体与菌株
• 1.6 试验试剂的配制
• 1.6.1 感受态细胞的制备
• 1.6.2 培养基的制备
• 1.6.3 质粒提取试剂的配制
• 1.7 引物
• 1.8 PRRS分析毒株
• 1.9 主要仪器
• 1.10 实验路线
• 1.11 RT-PCR诊断
• 1.11.1 可疑PRRS阳性病料病毒RNA的提取
• 1.11.2 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）
• 1.12 感受态细胞的制备
• 1.13 基因克隆
• 1.13.1 连接目的基因
• 1.13.2 转化
• 1.13.3 抽提质粒
• 1.13.4 重组质粒的酶切
• 1.14 目的基因的测序
• 1.14.1 目的基因序列的比较
• 1.14.2 病毒株的遗传演化分析
• 1.14.3 氨基酸同源性及其位点的变异情况分析
• 第二章 结果与分析
• 2.1 流行病学调查结果
• 2.2 临床症状观察结果
• 2.2.1 母猪的临床症状
• 2.2.2 公猪的临床症状
• 2.2.3 哺乳仔猪的临床症状
• 2.2.4 保育猪和生长猪的临床症状
• 2.2.5 育肥猪的临床症状
• 2.3 病变变化观察结果
• 2.3.1 哺乳仔猪的病理变化
• 2.3.2 保育猪及生长猪的病理变化
• 2.4 RT-PCR检测结果
• 2.5 PRRS阳性病料ORF5、ORF6和ORF7基因的扩增结果
• 2.6 ORF5基因的扩增、克隆、酶切鉴定及序列分析
• 2.6.1 ORF5基因的扩增结果
• 2.6.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.6.3 ORF5基因核苷酸和氨基酸序列的比较与分析
• 2.6.4 与国内外代表毒株的序列比较
• 2.6.5 18个广西流行毒株与国内外代表毒株的遗传进化树分析
• 2.6.6 E蛋白的糖基化位点、毒力及相关氨基酸的变异情况分析
• 2.6.7 E蛋白主要抗原表位的氨基酸比较
• 2.7 ORF6基因的扩增、克隆、酶切鉴定和序列分析
• 2.7.1 ORF6基因的扩增结果
• 2.7.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.7.3 ORF6基因序列的比较分析
• 2.7.4 ORF6基因核苷酸及氨基酸序列的同源性分析
• 2.7.5 ORF6基因核苷酸序列的遗传进化树
• 2.7.6 M蛋白的遗传与变异分析
• 2.8 ORF7基因的扩增、克隆、酶切鉴定和序列分析
• 2.8.1 ORF7基因的扩增结果
• 2.8.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.8.3 ORF7基因核苷酸和氨基酸序列的比较分析
• 2.8.4 ORF7基因核苷酸和推导氨基酸序列的同源性分析
• 2.8.5 根据ORF7基因核苷酸序列绘制的遗传进化树
• 2.8.6 N蛋白的遗传和变异分析
• 2.8.7 N蛋白抗原位点氨基酸的比较
• 第三章 讨论
• 3.1 高致病性猪繁殖与呼吸综合征流行病学调查分析
• 3.2 高致病性猪繁殖与呼吸综合征的症状和病变分析
• 3.3 ORF5、ORF6和ORF7基因序列分析
• 3.4 ORF5、ORF6和ORF7基因遗传进化分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录:英文缩写对照表
• 致谢
• 发表论文