吉非替尼对乳腺癌细胞生物学行为的影响

论文摘要

EGFR 是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）家族的成员,是利用分子遗传学方法发现的第一个细胞表面信号蛋白及原癌基因产物,具有受体分子的典型特征。乳腺癌中有14%～91%为EGFR高表达,而EGFR高表达与肿瘤的进展与预后密切相关,因此,针对EGFR的通路的研究及其靶向治疗,具有十分深远的意义。吉非替尼（Gefitinib,易瑞沙）是一种EGFR酪氨酸激酶小分子抑制剂,可以通过竞争性结合ATP抑制EGFR胞内酪氨酸激酶结构域的自身磷酸化,从而阻断下游信号的传递。目前,Gefitinib应用于非小细胞肺癌（NSCLC）已经较为成熟,而对于乳腺癌的应用,目前尚处于基础及临床试验阶段。我们在细胞水平上,考察了 Gefitinib对乳腺癌细胞生物学行为（包括增殖、凋亡、运动、耐药等）多个方面的影响,为其应用于临床提供了理论基础。我们首先通过Western Blotting筛选出EGFR表达阳性的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和T47D细胞系作为模型。通过磷酸化Western Blotting选择出最佳的EGFR通路激活条件为EGF（100ng/ml）37℃作用1Omin。进一步通过磷酸化Western Blotting验证Gefitinib对乳腺癌细胞系EGFR通路的阻断能力以评价其药效。结果显示Gefitinib可以靶向性阻断乳腺癌细胞T47D、MDA-MB-231胞膜EGFR的磷酸化,进而抑制其主要通路（Ras/Raf/ERK及PI3K/Akt）的活化水平。但其下游两个重要通路的关键蛋白Akt、ERK1/2的活化不能完全抑制,尤以MDA-MB-231细胞显著。针对Gefitinib对乳腺癌细胞增殖的作用,首先通过MTT实验初步评价了Gefitinib对MDA-MB-231及T47D细胞系存活的影响。结果显示Gefitinib在浓度为0.1μM、1μM、10μM、100μM时,对T47D细胞的抑制率分别为:（34.9±8.8）%、（42.6±5.0）%、（60.7±5.4）%、（89.2±0.2）%,其 IC50 为 3.61μM;对 MDA-MB-231细胞的抑制率分别为:（24.8±4.9）%、（22.4±3.7）%、（48.3±5.9）%、（56.9±3.8）%,后者对Gefitinib有一定的耐药性。为进一步探究Gefitinib对T47D细胞增殖抑制作用的机理,我们利用流式细胞术测定了 Gefitinib对细胞周期的影响。结果发现,Gefitinib可以显著抑制T47D细胞于G0/G1期,使细胞无法越过限制点,因此降低了细胞的增殖。通过倒置显微镜观察,我们同时发现Gefitinib作用后的T47D细胞部分出现凋亡形态。流式细胞术（AnnexinV/PI）进一步验证发现,Gefitinib（10μM）作用Oh、12h、24h后,细胞凋亡率分别为2.8%、72.8%及94.9%。为研究Gefitinib导致细胞凋亡的分子机制,我们通过Western Blotting发现,随着Gefitinib作用浓度的增加,Bcl-Xl表达逐渐降低,Bax表达逐渐增加,而Caspase-3及PARP的剪切也随之增加,呈明显的剂量依赖关系。即Gefitinib可通过经典的线粒体途径,引起T47D细胞的凋亡。针对Gefitinib对乳腺癌细胞运动的作用,我们首先通过划痕试验及趋化试验,发现Gefitinib可以明显延长MDA-MB-231细胞的划痕愈合时间,减少穿膜细胞个数,呈剂量依赖关系。进一步通过免疫荧光检测F-actin的分布情况,发现经Gefitinib作用后,细胞无明显片状伪足伸出,细胞F-actin聚合作用减弱,无明显的极性变化,为细胞运动能力降低的直接原因。针对Gefitinib对乳腺癌细胞耐药的影响,我们通过MTT试验、Western Blotting检验了 Gefitinib联合化疗药物Doxorubicin对MDA-MB-231细胞的作用,发现 Gefitinib 与 Doxorubicin 联用可明显降低 Doxorubicin 的 IC50、IC80,凋亡的标志性蛋白PARP也因Gefitinib的参与剪切增加。因此,Gefitinib可明显提高Doxorubicin的细胞毒作用,起到化疗增敏的效果。另外,Doxorubicin序贯Gefitinib的作用要明显高于两者同时给药;反之,Gefitinib序贯Doxorubicin的作用明显低于两者同时给药。综上所述,Gefitinib可通过抑制EGFR通路的活化,抑制乳腺癌细胞的增殖,促进凋亡过程,并抑制其趋化迁移能力,提高化疗药物的抗肿瘤作用。我们认为,Gefitinib可以为乳腺癌的治疗提供新的方法和思路。但我们的试验同时也显示,单独应用Gefitinib并不能完全抑制EGFR下游通路的活化,乳腺癌部分细胞表现出对Gefitinib 一定的耐药性,这就提示了临床应用中也许同时存在EGFR通路的耐药机制,联合其他靶向药物或化疗药物的综合治疗是非常必要的。另外,Gefitinib联合化疗用药顺序的不同,也产生了截然不同的作用效果,提示了临床应用中对于Gefitinib与化疗联合应用时也应注意用药方式的选择。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• 一、EGF对乳腺癌细胞生物学行为的影响
• 1.1 材料与方法
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 试验方法及步骤
• 1.2 结果
• 1.2.1 各乳腺癌细胞系EGFR的表达
• 1.2.2 不同时间EGF刺激后EGFR活化水平
• 1.2.3 不同浓度EGF诱导MDA-MB-231细胞趋化运动
• 1.3 讨论
• 1.4 小结
• 二、Gefitinib对乳腺癌细胞存活及凋亡的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法及步骤
• 2.2 结果
• 2.2.1 Gefitinib对T47D、MDA-MB-231细胞EGFR通路的抑制作用
• 2.2.2 MTT试验检测Gefitinib对细胞存活的影响
• 2.2.3 流式细胞术检测Gefitinib对细胞周期的影响
• 2.2.4 流式细胞术（Annexin Ⅴ/PI）检测Gefitinib对细胞凋亡过程的影响
• 2.2.5 Western Blotting检测Gefitinib对细胞凋亡通路的影响
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 三、Gefitinib对乳腺癌细胞运动能力的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法及步骤
• 3.2 结果
• 3.2.1 Gefitinib对MDA-MB-231细胞划痕愈合能力的影响
• 3.2.2 Gefitinib对MDA-MB-23 1细胞趋化能力的影响
• 3.2.3 Gefitinib对MDA-MB-231细胞骨架的影响
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 四、Gefitinib对乳腺癌细胞的化疗增敏作用初探
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 试验方法及步骤
• 4.2 结果
• 4.2.1 MTT试验检测Gefitinib联合化疗药物Doxorubicin对MDA-MB-23
• 4.2.2 Western Blotting检测Gefitinib联合化疗药物Doxorubicin对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 EGFR家族在肿瘤细胞中的作用及研究进展
• 综述参考文献
• 致谢