水稻包穗基因ESP2的表达与功能分析

论文摘要

目前水稻生产中所应用的籼型不育系均存在不同程度的包穗,产生的主要原因是水稻不育系的倒一节间缩短。因此,克隆包穗有关基因,阐明其分子机制,将为培育水稻不育系新种质奠定理论基础,具有重要的意义。我们从籼稻恢复系明恢86组织培养后代中获得了一种新的包穗突变体esp2（enclosed short panicle）。该突变体的营养生长正常、且能正常结实,但其穗部被剑叶叶鞘完全包裹。遗传分析表明,该包穗突变体为单隐性突变。推测ESP2很可能是特异控制水稻倒一节间发育的关键基因。目前,本课题组已精细定位并确定了ESP2的候选基因。在此基础上,本论文利用生物信息学分析方法,对ESP2候选基因的生物学功能和启动子序列进行预测和分析；利用GUS表达和过量表达方法对ESP2候选基因的表达特征和功能进行分析,获得的主要结果如下：（1）利用生物信息学分析方法,对ESP2候选基因的生物学功能进行预测,并对ESP2基因的启动子序列进行分析。结果表明,ESP2候选基因编码的蛋白质与磷脂酰丝氨酸合成酶（PSS）具有很高的同源性,该酶包含有2个跨膜结构域。因此推测ESP2可能是一种膜蛋白。PSS普遍存在于植物、动物和微生物中,其功能主要是催化磷脂的生物合成,而磷脂是细胞膜磷脂的重要组成成分,对细胞的新陈代谢具有重要的调节作用。利用BDGP生物学软件对ESP2基因的启动子序列分析发现,在ESP2基因ATG上游348bp-398bp和2780bp-2830bp区域含有两个核心启动子序列。因此,我们选择3570bp作为ESP2的启动子序列。（2）构建了ESP2启动子的GUS表达载体pESP2：GUS并转化粳稻品种中花15,获得了19株转基因植株。GUS染色结果显示,ESP2在根、叶、各节和节间以及幼穗中均有表达,且在倒一节间和穗茎节表达较强,但在营养生长期的茎尖没有表达。在成熟的小穗中,ESP2在花器官的内/外稃和花药中表达较强,但在雌蕊和浆片中表达很弱或没有表达。（3）构建了ESP2基因的过量表达载体Ubi：ESP2并转化粳稻品种中花15,获得了27株转基因植株。定量PCR分析结果表明,过量表达植株转基因中ESP2的表达水平明显增强,但ESP2转基因植株的表型与亲本植株的表型没有明显改变。我们拟对T1代中转基因植株与非转基因植株的表型进行进一步的观察与分析。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 文献综述
• 1 水稻包穗的研究进展
• 1.1 水稻的包穗现象
• 1.2 水稻包穗基因的研究现状
• 1.3 水稻矮杆突变体的研究进展
• 1.4 磷脂酰丝氨酸合成酶的生物学特性
• 1.5 磷脂酰丝氨酸合成酶的研究进展
• 2 植物基因功能验证的一般方法
• 2.1 功能互补实验
• 2.2 RNA干扰
• 2.3 基因的过量表达与RT-PCR
• 2.4 转基因植株的检测方法
• 材料与方法
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 本试验所用载体
• 1.3 常用分子生物学试剂
• 2 实验方法
• 2.1 生物信息学分析的工具
• 2.2 载体构建
• 2.2.1 pESP2：GUS表达载体构建
• 2.2.2 Ubi：ESP2过量表达载体的构建
• 2.2.3 RT-PCR分析转基因植株中ESP2的表达
• 2.3 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.3.1 传统侵染成熟胚愈伤的方法
• 2.3.1.1 接种
• 2.3.1.2 掐芽
• 2.3.1.3 继代
• 2.3.1.4 农杆菌介导的水稻遗传转化
• 2.3.1.5 抗性愈伤的继代筛选与再生植株
• 2.3.2 培养基
• 2.4 GUS基因的活性检测（组织化学定位法）
• 2.5 转基因植株的检测
• 2.5.1 转基因植株潮霉素引物的PCR检测
• 2.5.2 转基因植株的潮霉素溶液检测
• 结果与分析
• 1 ESP2基因的生物信息学分析
• 1.1 ESP2候选基因编码一种磷脂酰丝氨酸合成酶蛋白
• 1.2 ESP2可能是一种膜蛋白
• 1.3 ESP2基因启动子的生物信息学分析
• 2 pESP2：GUS表达载体构建及遗传转化
• 2.1 pESP2：GUS载体的构建
• 2.2 pESP2：GUS载体的遗传转化及检测
• 2.3 GUS活性检测
• 3 ESP2的过量表达载体的构建及遗传转化
• 3.1 Ubi：ESP2表达载体的构建
• 3.2 Ubi：ESP2表达载体的遗传转化及检测
• 3.3 ESP2过量植株表达水平的分析
• 讨论
• 1 ESP2是一个调节水稻倒一节伸长的关键基因
• 0表型与非转基因植株表型没有明显差异的原因'>2 ESP2转基因过量植株T₀表型与非转基因植株表型没有明显差异的原因
• 3 下一步的工作
• 参考文献
• 附录
• 附录1 本论文所使用的表达载体的结构示意图
• 附录2 分子生物学实验中PCR体系的建立
• 附录3 本实验所用的其他实验方法
• 附录4 本实验所用基本培养基配方
• 附录5 GUS活性检测重要溶液
• 附录6 ESP2启动子的序列分析
• 附录7 缩写词
• 致谢