导读:本文包含了生殖与更新论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:雄性生殖干细胞,DMRT1,自我更新,分化
生殖与更新论文文献综述
魏于栋[1]（2019）在《DMRT1调控山羊雄性生殖干细胞分化、自我更新的机理》一文中研究指出雄性生殖干细胞(male germ stem cell,mGSCs),同样被称作精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是位于睾丸曲细精管基底膜上,既能通过自我更新维持自身群体数量的稳定,又能在体内定向分化并最终形成精子的一类成体干细胞。雄性生殖干细胞可以作为研究精子发生、减数分裂调控和细胞重编程的一个理想体外模型。Double sex and mab-3 related transcription factor 1(DMRT1)基因编码的蛋白质包含一个double sex/mab-3结构域,无论是在脊椎动物或者无脊椎动物中,这个最保守的结构域都会参与个体的性别决定过程。除此之外,DMRT1参与雄性生殖干细胞的损伤修复、抑制睾丸肿瘤、维持雄性生殖干细胞有丝分裂与减数分裂的平衡并且调控雄性生殖干细胞的多能性。因此,探究DMRT1在雄性生殖干细胞中的功能机制,可以为提高动物遗传育种、动物疾病模型和物种保护提供理论指导。在本研究中我们首次研究了DMRT1对山羊雄性生殖干细胞分化和自我更新过程中的影响,以及DMRT1在睾丸生殖免疫中发挥的功能。实验结果如下:1.DMRT1基因在哺乳动物中广泛存在且不同物种中序列高度保守,多序列比对的结果发现6种哺乳动物的DMRT1基因序列一致性达到了86.42%。对于其核心结构域DM结构域分析表明,不同物种的氨基酸序列基本一致,说明DM结构域在不同物种中同样具有高度保守性。为了探究DMRT1在山羊不同组织的表达情况,免疫荧光染色结果表明DMRT1在山羊睾丸中特异表达。染色及定量PCR进一步发现DMRT1在1月龄山羊睾丸的表达量很低,3月龄睾丸起始减数分裂后DMRT1表达明显上调,至个体成熟其表达水平趋于稳定。其次,利用免疫荧光共染色揭示了DMRT1主要定位在未分化和分化中的雄性生殖干细胞中,但是在启动减数分裂的精母细胞中却没有表达。根据以上结果,我们认为DMRT1主要在雄性生殖干细胞中发挥功能,对于mGSCs的分化和增殖发挥重要作用。2.FUW-TetO-Dmrt1慢病毒载体配合rtTA辅助质粒转染雄性生殖干细胞及永生化的mGSCs-I-SB细胞系,筛选出最适诱导DMRT1表达的Dox浓度。EDU、双荧光素酶检测、免疫荧光染色、Western blotting、及定量PCR进一步揭示DMRT1对于山羊雄性生殖干细胞发育过程的功能。在1μg/mL Dox诱导条件下,雄性生殖干细胞增殖能力及分化水平显着增高,减数分裂相关标记相应下调。维甲酸引起雄性生殖干细胞的减数分裂,但过表达DMRT1抑制减数分裂的发生同时mGSCs的增殖标记PCNA及分化标记c-KIT表达上调。因此DMRT1一方面促进雄性生殖干细胞的增殖和分化,另一方面抑制由RA引起的减数分裂异常起始,从而维持精原细胞有丝分裂和减数分裂的平衡。3.DMRT1在睾丸生殖免疫中发挥重要功能,DMRT1通过抑制TLRs信号通路从而降低雄性生殖干细胞中炎症反应的发生。shRNA干扰睾丸雄性生殖干细胞中DMRT1的表达,转录组测序及免疫组化试验结果显示mGSCs中TLR4及NF-κB被激活。ELISA及Western blotting检测发现雄性生殖干细胞内促炎因子TNFα及IL-6的表达上调。免疫共沉淀及双荧光素酶检测试验进一步揭示DMRT1招募PLZF蛋白,二者共同抑制TLR4和NF-κB的转录并促进雄性生殖干细胞数量的回补。与此同时,TUNEL染色及流式细胞术发现DMRT1抑制由炎症反应引起的雄性生殖干细胞的凋亡。综合以上结果表明DMRT1在促进雄性生殖干细胞自我更新及维持睾丸内环境稳态中的重要功能,提供了治疗睾丸生殖缺陷疾病的新思路。4.白消安处理的小鼠睾丸表现出严重的生殖细胞损伤,过表达DMRT1显着恢复了雄性生殖干细胞的数量并且维持精子发生的正常进行。免疫荧光染色及ELISA检测的结果表明DMRT1促进雄性生殖干细胞增殖标记PCNA、VASA及自我更新相关标记PLZF及CSF1R的表达。同时mGSCs自我更新相关的细胞因子GDNF、CSF1表达上调,从而证明DMRT1对睾丸内环境的重建至关重要。基于双分子荧光互补技术(BiFC)和免疫共沉淀检测,最终确认DMRT1蛋白与PLZF蛋白互作主要是由DMRT1与PLZF的BTB结构域互作来实现的。所以DMRT1与PLZF发挥协同作用参与雄性生殖干细胞自我更新下游通路的调节。除此之外,DMRT1和PLZF作为抑炎因子有效地抑制曲细精管内炎症的发生,为雄性生殖细胞损伤的修复建立了良好的微环境。综上所述,我们首次探究了DMRT1在雄性生殖干细胞中的表达模式,探索了DMRT1对山羊雄性生殖干细胞分化和自我更新过程的影响,并揭示DMRT1在生殖免疫中发挥的功能。基因修饰载体转染山羊雄性生殖干细胞,体内体外综合分析、验证筛选DMRT1可能作用的特异靶基因及其互作机制,为研究山羊雄性生殖干细胞的自我更新、精子发生的机理提供新的科学依据;为高产优质家畜的遗传、繁育和不育症的防治提供新方案。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2019-05-01）
胡兴,陈霞,颜一丹,栾晓瑾,于骏[2]（2018）在《CG5033基因在果蝇睾丸中调控生殖干细胞的自我更新和分化》一文中研究指出目的:探讨CG5033基因在果蝇睾丸中对生殖干细胞自我更新和分化过程的影响。方法:采用UAS/Gal4系统驱动果蝇睾丸生殖干细胞(nos-Gal4)、分化的精原细胞(bam-Gal4)和包囊细胞(tj-Gal4)中UAS-CG5033 RNAi的表达。在F1代果蝇中挑选单只nos>CG5033 RNAi、bam>CG5033 RNAi及tj>CG5033 RNAi基因型成年雄蝇,与3只野生型处女蝇杂交,观察是否可获得后代果蝇;通过光学显微镜和免疫荧光染色方法观察野生型和CG5033 RNAi雄性果蝇睾丸中Vasa、眼缺陷蛋白(eyes absent,Eya)、DE-cad、锌指结构域1蛋白(Zn finger homeodomain 1,Zfh1)和1B1的表达模式。结果:与野生型果蝇组比较,nos>CG5033 RNAi组和tj>CG5033 RNAi组果蝇呈雄性不育,而bam>CG5033 RNAi果蝇组生育率未受影响。光学显微镜下,与野生型果蝇组比较,用nos-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi雄性果蝇的睾丸明显变小。免疫荧光染色结果表明,与野生型果蝇组比较,用nos-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi的雄性果蝇睾丸中的生殖细胞消失,包囊细胞代偿性增多,而用tj-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi的果蝇睾丸中出现生殖细胞肿瘤;bam>CG5033 RNAi睾丸未见明显异常。结论:CG5033基因编码的蛋白在果蝇睾丸生殖干细胞中影响细胞的自我更新能力,并可通过体细胞干细胞影响生殖干细胞的分化过程,最终导致生殖细胞肿瘤的形成。(本文来源于《江苏大学学报(医学版)》期刊2018年05期）
翟源心,郑丽明,华进联[3]（2016）在《E-cadherin对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新与增殖的影响》一文中研究指出E-钙粘素(E-cadherin)是干细胞微环境的重要组成部分,其蛋白结构在各物种间具有较高的保守性,影响精原干细胞的自我更新、增殖和分化等多个环节,对精原干细胞具有复杂的调控作用。为探索Ecadherin对奶山羊(Capra hircus)雄性生殖干细胞(male germline stem cells,m GSCs)自我更新与增殖的影响,本研究将E-cadherin真核超表达载体p E-cadherin-GFP转染奶山羊m GSCs,检测钙粘素1基因(cadherin 1,CDH1)超表达的作用。结合q RT-PCR、Western blot和免疫荧光染色等方法检测E-cadherin及与细胞增殖、多能性相关的标记基因的变化。结果表明,E-cadherin超表达组的奶山羊m GSCs相对于对照组细胞E-cadherin的表达量明显上调,与细胞自我更新和增殖相关的基因整合素α6(integrin alpha-6,CD49f)、神经胶质细胞源性的神经营养因子家族受体α1(glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor alpha-1,GFRα1)、早幼粒细胞白血病锌指基因(promyeloeytie leukaemia zinc-finger,PLZF)、八聚体结合转录因子(octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达明显上调。另外,本研究通过免疫组化技术对成年奶山羊睾丸组织进行E-cadherin表达检测,发现E-cadherin阳性细胞明显较多位于曲细精管基底膜的精原干细胞存在部位。初步说明E-cadherin可能会促进奶山羊m GSCs的增殖及多能性的维持。本研究为奶山羊m GSCs增殖分化等研究提供分子基础,有助于建立稳定的雄性生殖干细胞株。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2016年09期）
武思宇[4]（2016）在《深度测序法筛选和鉴定维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的关键因子》一文中研究指出精原干细胞(Spermatogonial Stem Cells,SSCs),也称为雄性生殖干细胞,是位于睾丸组织曲细精管基基底膜上的一种成体干细胞,雄性生殖干细胞通过自我复制维持自身群体数量的稳定,又可发育分化成可遗传的配子-精子。SSCs是研究精子发生、减数分裂的分子调控和细胞重编程的一个理想的体外模型。雄性生殖干细胞作为精子发生过程中的起源性细胞,其本身具有维持自我更新和分化的双重性能,该种干细胞中存在复杂而又精密的调控机制。SSCs中存在的这一复杂而又庞大的调控网络必然也伴随着大量的调控因子,包括coding-RNA水平的基因,转录因子以及nocoding-RNA水平的miRNA,siRNA和lncRNA。为宏观整体地了解SSCs中可能存在的维持干性的调控因子,常规的试验验证方法已经不能够达到验证目的,随着DNA测序技术的飞速发展,第二代测序技术能够一次性完成DNA分子序列测定通量高达几十万到几百万条。使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。本研究将基于奶山羊这一物种对维持雄性生殖干细胞的自我更新相关因子进行筛选、鉴定及其作用机理的分析研究。已有报道Pax7可以作为小鼠睾丸中少量细胞群所表达的特异、全新的细胞标记,被相继应用到人类、灵长类等其他物种上。本实验通过Hiseq2000高通量测序平台对了奶山羊CD49f阴、阳性睾丸细胞的转录组表达谱进行测序,分析两类细胞中精原干细胞标记基因的表达特征。之后试验鉴定分选出的CD49f阳性睾丸细胞是奶山羊的精原干细胞群;并进一步从个体、细胞和分子水平研究了候选基因Pax7对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新功能和细胞增殖的影响。1.奶山羊精原细胞的转录组表达谱利用免疫磁珠分选法和Hiseq2000深度测序分析技术获得了CD49f阴、阳性睾丸细胞的转录组表达谱,CD49f阴、阳性精原细胞中共同表达的有28880条基因,确定了574个在CD49f阳性睾丸细胞中表达上调2倍的基因和1426个在CD49f阴性睾丸细胞中上调2倍的基因。GO分析可得,1026(54%)个差异基因富集归类到“精子发生”(GO:0007283),有58个基因属于该GO项目下。分组分析表达量上下调的差异基因,发现在pathway通路分析中,CD49f阴性组表达量较高的基因能够富集到“Oocyte meiosis”(PATH:04114)通路上。2.Pax7基因在奶山羊睾丸中的功能作用利用QRT-PCR技术检测Pax7基因在奶山羊睾丸组织中表达规律,发现随年龄的增长,Pax7基因在逐渐减少。免疫荧光切片染色发现,Pax7基因特异的表达在曲细精管基底膜上的精原干细胞,但只有少量可着色,因此可将Pax7作为奶山羊早期精原干细胞的标记。利用NCBI数据库,通过电子克隆的方法获得奶山羊的Pax7全长序列并构建过表达载体pPax7-mCherry-N1。在mGSCs中过表达Pax7,结合QRT-PCR、免疫荧光染色等实验技术检测mGSCs中与自我更新与分化相关基因的变化情况,发现过表达Pax7组的细胞能较好的维持自我更新相关的基因PLZF、GFRa1、ID4、OCT4的表达,Pax7基因在奶山羊精原干细胞中过量表达在转录和蛋白水平促进PLZF,ID4,OCT4等多能性和自我更新相关基因的表达,可在一定水平上促进自我更新能力的维持。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-05-01）
郑丽明[5]（2016）在《Tet1对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新与增殖的表观修饰调控》一文中研究指出奶山羊是我国重要的经济动物,保持和优良奶山羊品种,实现快速繁殖是现代农业的目标,奶山羊雄性生殖干细胞(male germline stem cell,mGSCs)自我更新的维持和发育分化的相关基础性研究也逐步深入,家畜mGSCs体外培养体系不稳定、重编程效率低等问题都亟待解决。研究表明表观修饰在精子发生过程中发挥着重要的调控作用。特定位点的DNA甲基化动态变化是维持正常精子发生的关键。Tet1(Ten-eleven translocation 1)作为主要的去甲基化酶,参与精子发生的表观修饰调控进程。因此,开展mGSCs的表观遗传学研究,不仅有助于探究成体干细胞体外培养技术的优化体系,推进mGSCs自我更新与分化机理的探索;而且在畜牧业生产上对提高优良种畜的精子质量,减少疾病发生,促进家畜大动物优良品种的遗传与繁育有重要意义。本研究以奶山羊为研究对象,对Tet1及产物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)进行表达谱和定位分析,同时探究了奶山羊精子发生过程中的dimethyl histone H3 lysine 9(H3K9me2)和tri-methyl H3 lysine 9(H3K9me3)在不同年龄阶段睾丸组织的甲基化模式;利用Tet1过表达的方法修饰mGSCs并筛选阳性单细胞克隆,观察细胞形态学、基因表达差异和DNA甲基化、组蛋白甲基化的变化;通过自发分化与体内移植对Tet1过表达的mGSCs进行功能验证,并分析Tet1与蛋白互作的调控机理。结果发现:(1)Tet1在奶山羊睾丸组织中表达水平较低,且主要分布于曲细精管基底膜的精原细胞中;对其产物5hmC在不同年龄阶段奶山羊睾丸组织中的含量与定位进行检测,表明5hmC随年龄增加而降低,且在mGSCs与支持细胞都有分布;奶山羊精子发生过程中的组蛋白H3K9me2在不同年龄阶段睾丸组织呈现先升后降的模式,在青春期达到峰值;而H3K9me2含量则是随年龄增长持续缓慢升高。成年睾丸组织中dimethyl histone H3 lysine 4(H3K4me2)定位于减数分裂后期的圆形精细胞,tri-methyl H3 lysine 27(H3K27me3)在mGSCs中呈现特殊的核周定位;在体外培养的mGSCs中,Tet1在维持自我更新的mGSCs中表达,在分化状态下表达降低;5hmC与其表现同样的趋势;同时对体外培养的mGSCs中H3K9me2和H3K9me3进行检测,发现维持自我更新的mGSCs克隆和趋于分化的克隆及未形成克隆的细胞相比含量含量较低。(2)生物信息学分析不同物种间Tet1基因的遗传同源性和保守结构域,通过对Tet1基因共有的发挥功能关键的识别结构域和催化结构域进行分析,确定小鼠Tet1(mTet1)在山羊源细胞中发挥作用;筛选Dox诱导表达mTet1的阳性单细胞克隆,在基因、mRNA和蛋白水平进行鉴定后观察细胞形态,发现mTet1阳性细胞细胞核变大,且5hmC含量增加;通过阶梯浓度培养确定0.50μg/mL的Dox浓度为最佳的诱导培养浓度;QRT-PCR、免疫荧光染色和western blot检测发现mTet1阳性细胞中Gfra1、PCNA、CCND1、Ki67、ETV5等增殖和生殖特异性标志基因表达上调,分化特异性基因REC8表达下调;Tet1过表达的奶山羊mGSCs的阳性细胞,组蛋白甲基化相关的H3K9me2和H3K9me3含量有所下降,且H3K9me3由细胞核内颗粒状分布转变为均匀分布;H3K27me3含量显着降低,由细胞核内均匀分布转变为向核周分布。(3)构建过表达Tet1慢病毒载体,对筛选出的稳定过表达Tet1的奶山羊mGSCs阳性克隆(mGSC-pCDH-mTet1)细胞进行QRT-PCR检测,筛选出既能维持mGSCs自我更新又促进细胞增殖的克隆;制备mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的类胚体(EBs),自发分化试验检测体外分化能力,发现mGSC-pCDH-mTet1细胞自发分化后的细胞叁胚层分化的速度较慢,说明mTet1具有维持自我更新、抑制分化的功能;对生殖缺陷小鼠模型进行mGSC-pCDH-mTet1细胞和mGSC-pCDH细胞的曲细精管移植,4周采集睾丸,制成石蜡切片,并进行PGP9.5、VASA、PCNA、Ki67等生殖与增殖相关特性标记的检测,证实mGSC-pCDH-mTet1细胞在生殖缺陷小鼠的曲细精管内不仅维持mGSCs的特性,还有显着的增殖能力。(4)对mTet1在mGSCs中发挥作用的方式进行分析,确认mTet1通过上调组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达,下调H3K27me3的含量并发生从核内向核周分布的定位变化,此过程伴有MEK-ERK信号通路的抑制;mTet1通过与Hdac1形成蛋白复合体,共同调节组蛋白乙酰化状态,进行mGSCs的表观修饰调控;mTet1与PCNA形成蛋白复合体,通过mTet1过表达来促进mGSCs的增殖。综上所述,本研究从体内和体外分析了Tet1在奶山羊曲细精管和细胞中的分布;同时研究Tet1修饰引起的形态变化和基因调控机理。这不仅为精子发生过程中Tet1表达调控进一步的研究提供思路,为更深入探究表观修饰调控在奶山羊mGSCs的发育与分化作用奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-04-01）
周芳月,李佳,潘泽政,梁夏,郑月慧[6]（2015）在《Hippo-YAP通路在多种干细胞尤其是卵巢生殖干细胞自我更新中作用的研究》一文中研究指出干细胞(stem cell,SC)是一类具有自我复制能力(self-renewal)的多潜能细胞,在干细胞微环境中能不断地进行自我更新,即通过自身增殖分裂和抑制分化来增加细胞的数目,且保持细胞的多能性。Hippo通路下游效应分子YAP为一癌基因,可与转录因子TEAD结合,形成一种强效的转录共激活因子。在生理条件下,通过激酶级联反应,YAP被磷酸化,其转录活性被抑制,从而限制器官的过度生长和抑制肿瘤的发生。研究已经证实,YAP的活化可以促进细胞的增殖并抑制细胞的分化,是一个高效的增长诱导剂。YAP在多能干细胞、神经干细胞、造血干细胞及表皮干细胞等的增殖和分化中起重要的作用,并可能调节卵巢生殖干细胞的增殖和分化。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2015年07期）
吴梦,熊家强,卢智勇,罗爱月,王世宣[7]（2015）在《雌性生殖干细胞自我更新和分化的调控因素研究进展》一文中研究指出最新研究表明,雌性哺乳动物卵巢内存在雌性生殖干细胞(FGSCs),而且这种FGSCs在体内可以分化为卵子并产生后代。这一发现打破了传统的观点即雌性哺乳动物在出生时即拥有不可更新的卵细胞,出生后不断地耗竭,直到卵巢衰老。从而为医学以及其他相关产业提供了广阔的运用前景。同时也说明了FGSCs不仅仅存在于低等生物如果蝇、线虫等体内,在哺乳动物中也普遍存在。然而目前对FGSCs在体(本文来源于《中国妇幼保健》期刊2015年20期）
宋文聪[8]（2014）在《miR-544靶向PLZF调控奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新》一文中研究指出雄性生殖干细胞（mGSCs）的增殖与分化决定哺乳动物的精子发生的起始，mGSCs自我更新的维持是雄性动物精子持续并大量产生的基础。mGSCs的自我更新与增殖分化都是精密调控的有序循环过程，研究调控mGSCs的自我更新与增殖分化的因子对理解精子发生具有重要意义。早幼粒白血病锌指蛋白（PLZF）是一个同时包含9个锌指结构和一个BTB/POZ结构的锌指蛋白，它通过募集转录抑制共轭物来抑制靶基因的表达。在小鼠和人的研究中表明，PLZF能维持雄性生殖干细胞的自我更新，抑制细胞分化，它能与众多分化相关因子形成一个平衡调节网络，进而维持雄性生殖干细胞池的细胞数量稳定。miRNAs是当前生命各领域研究的热点之一，研究发现miRNAs在多种生物事件中扮演重要的调控角色，这些生物事件包括细胞增殖，分化和凋亡。探索miRNAs调节靶基因的转录，mRNA的稳定性以及翻译机制是阐明睾丸发育及雄性生殖干细胞自我更新与分化的一个重要的科学问题。miR-544是14q32miRNA-clusters中18个miRNA之一，在多种肿瘤中影响肿瘤细胞的增殖及细胞周期，可作为神经胶质瘤恶性转变恶性转变及急性成淋巴细胞性白血病诊断的标志之一。本研究以PLZF为研究主线，通过在线生物信息学数据库预测靶向PLZF的上游miR-544。在分离纯化的原代及传代mGSCs中共转染PLZF-3’UTR双荧光素酶报告基因野生型（或突变型）载体与miR-544模拟物（miR-544m）、抑制剂（miR-544i）及无义物（NC），对miR-544-PLZF信号通路调控mGSCs自我更新与分化作用进行研究，发现miR-544能通过靶向抑制PLZF而促进奶山羊mGSCs分化。1. PLZF调控mGSCs的自我更新我们通过免疫组化技术分别对30dpp,6月,10月叁个年龄段的奶山羊睾丸进行PLZF表达检测，发现PLZF在6月龄的奶山羊睾丸中表达量最高，其后依次为30dpp和10月龄。利用NCBI数据库，通过电子克隆的方法获得奶山羊的PLZF全长序列并构建过表达载体pPLZF-IRES2-EGFP。在mGSCs中过表达PLZF，结合QRT-PCR,免疫荧光等实验技术检测自我更新与分化相关基因的变化，发现过表达PLZF组的细胞能较好的维持自我更新相关的基因PGFRa1、VASA、OCT4的表达，同时维持细胞较高的增殖能力（BRDU表达水平较高）。相反，在未转染PLZF组的细胞中上述基因则发生了明显表达丢失，增殖能力下降。验证了PLZF在一定程度上能抵抗高浓度血清引起的细胞分化从而初步证实PLZF能维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新。2.直接靶向PLZF的miRNA筛选及验证运用生物信息学软件Targetscan筛选出可能直接靶向PLZF的4个miRNAs—miR-544、miR-370、miR-874、miR-378，再通过初步的转染实验将以上4个miRNAs分别转染mGSCs并检测PLZF的表达，然后将挑出的miR-544、miR-378再分别与psiCHCEKTM-2-PLZF-3’UTR共转染到Hela细胞进行双荧光素酶检测进一步筛选出miR-544。最后再通过双荧光素酶将miR-544模拟物及无义物（NC）分别与psiCHCEKTM-2-PLZF-3’UTR及psiCHCEKTM-2-Mut-PLZF-3’UTR载体共转Hela细胞，结合Western blot试验验证PLZF为miR-544的靶标基因。3. miR-544在mGSCs自我更新调控中的作用mGSCs中转染miR-544的模拟物和抑制物后观察mGSCs的形态变化、凋亡样细胞出现的比例，再结合QRT-PCR, Western blot和流式细胞周期检测等实验技术检测自我更新与分化相关基因的变化。结果发现miR-544能使mGSCs细胞体积变大、凋亡样细胞明显增多，同时抑制雄性生殖干细胞自我更新相关的基因如PLZF、CXCR4和GFRa1而促进雄性生殖干细胞的分化相关的基因KIT、DAZL等的表达。以上结果表明，miR-544通过下调靶基因PLZF,促进奶山羊mGSCs的分化。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2014-05-01）
孙军伟[9]（2011）在《GDNF对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的调控》一文中研究指出雄性生殖干细胞(male germ-line stem cells,mGSCs),也称作精原干细胞(SSCs),是近年来生物学研究中最活跃、最具有吸引力的领域之一,雄性生殖干细胞的研究在畜牧生产、生物医学等领域具有广泛的应用前景。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)是第一个被发现的调控mGSCs自我更新的生长因子。研究表明,GDNF是调控mGSCs体外自我更新最基础的生长因子,其调控作用具有剂量依赖性。小鼠雄性生殖干细胞系的研究显示,GDNF对mGSCs的自我更新的调控主要通过PI3K/Akt、Ras/Erk1/2、Src家族激酶等信号通路来实现,但对于不同的物种、不同的细胞系,GDNF主要介导的信号通路却不尽相同,同时GDNF对牛、山羊等动物mGSCs增殖的调控是否依赖于这几条信号通路未见报道。本研究检测了不同时期奶山羊睾丸组织中GDNF家族受体的表达情况,进一步分离纯化了奶山羊mGSCs,并对其进行了生殖细胞及多能性细胞特异性表面抗原的检测。然后采用不同浓度梯度的GDNF(0 ng/mL,5 ng/mL,10 ng/mL,20 ng/mL)对奶山羊mGSCs进行培养,筛选出维持奶山羊mGSCs自我更新的最适GDNF浓度。最后通过在含GDNF的奶山羊mGSCs培养液中添加PI3K及MEK的特异性抑制剂,初步筛选出GDNF作用于奶山羊mGSCs的主要信号通路。1. GDNF家族受体GFRa1的表达情况采用RT-PCR及免疫组织化学的手段,对GDNF家族受体GFRa1在胎儿、新生羊、青春期及成年等不同年龄时期奶山羊睾丸组织中的表达进行了研究。RT-PCR结果显示,GFRa1在胎儿期表达比较强,随着年龄的增长其表达量逐渐降低,而免疫组化结果则显示GFRa1仅在成年睾丸组织中表达。这说明GFRa1在奶山羊睾丸组织中有表达,但表达规律可能与小鼠和人的不大相同。2.奶山羊mGSCs的分离纯化及鉴定采用混合酶(胶原酶2 mg/mL,DNA酶20μg/mL,分解酶2 mg/mL)消化奶山羊睾丸组织,比较了纤粘连蛋白差速2 h贴壁细胞及未贴壁细胞的碱性磷酸酶(AP)染色,发现差速2 h未贴壁细胞所形成的克隆AP染色着色较深,且整个克隆着色,而2 h贴壁细胞所形成的克隆呈现部分AP阳性,说明差速2 h未贴壁细胞中mGSCs含量较高。然后对差速2 h未贴壁细胞进行了生殖细胞及多能性细胞表面抗原(GFRa1、CD49f、Stra8、Vasa、TERT、Oct4)免疫荧光染色,发现这些细胞均呈现阳性,说明得到了比较纯的奶山羊mGSCs。3. GDNF最适浓度的筛选采用含不同浓度梯度GDNF(0 ng/mL,5 ng/mL,10 ng/mL,20 ng/mL)的奶山羊mGSCs培养液培养纯化的奶山羊mGSCs,经群体倍增时间、细胞增殖能力(PCNA、BrdU免疫荧光染色)及细胞多能性的表达比较分析表明10 ng/mL GDNF组培养的mGSCs其群体倍增时间较其他各组短,增殖能力明显强,而多能性基因的表达无明显差异,从而确定10 ng/mL的GDNF为维持奶山羊mGSCs自我更新的最适浓度。4. GDNF所介导信号通路研究采用奶山羊mGSCs对照培养液、含10 ng/mL GDNF培养液、含10 ng/mL GDNF+10μmol/L PI3K抑制剂及含10 ng/mL GDNF+10μmol/L MEK抑制剂的培养液培养纯化的奶山羊mGSCs,经群体倍增时间、细胞增殖能力、多能性基因的表达以及通过RT-PCR、荧光定量PCR、Western Blotting及细胞周期检测等分析表明,GDNF可通过PI3K/Akt及MEK/ERK1/2两条信号通路调控奶山羊mGSCs自我更新,且发现GDNF可能主要通过PI3K/Akt信号通路起作用。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2011-05-01）
张长庆[10]（2008）在《黄土高原丘陵沟壑区刺槐人工林和狼牙刺天然林生殖与更新研究》一文中研究指出黄土高原丘陵沟壑区水土流失严重,生态脆弱,物种更新困难,某种程度上影响了当地人们的生产生活。本研究选择了黄土高原丘陵沟壑区不同生境的刺槐人工林群落和狼牙刺天然林群落,系统研究了刺槐群落和狼牙刺群落种群结构、群落的物种多样性、土壤水分效应、外界环境对种群的影响、种群的生殖更新情况,对不同生境刺和狼牙刺群落进行了种群更新综合性评价,确定了刺槐和狼牙刺种群在黄土高原丘陵沟壑区的适生范围,为黄土高原丘陵沟壑区植被恢复和重建提供了理论依据。1.通过对刺槐人工林种群结构、群落内土壤水分效应、群落物种多样性、外界环境对种群的影响、种群的生殖更新情况分析表明,在黄土高原丘陵沟壑区刺槐人工林群落不同生境条件下物种多样性指数大致呈阴坡下部﹥阳坡下部﹥阴坡上部﹥阳坡上部的趋势;有性生殖表现为阴坡下部果实产量最多(1140/标准株),其余叁个生境差别并不大;其无性生殖潜力表现为:阴坡下部(0.867)﹥阳坡下部(0.808)﹥阴坡上部(0.793)﹥阳坡上部(0.444)。刺槐人工林在阴坡下部能够通过无性繁殖进行良好的自我更新,中幼龄个体多,属于进展型种群,种群能够长期稳定存在下去。而在阳坡上部和峁顶的刺槐群落幼苗更新数量少或没有幼苗更新,种群属于一种衰退型的,不稳定的群落,水分尤其匮乏,直接影响了刺槐的生长。因此刺槐造林应选在阴坡下部和沟谷等水分条件较好的生境,并要施加适当的抚育措施。2.通过对狼牙刺天然林种群结构、群落内土壤水分效应、群落物种多样性、外界环境对种群的影响、种群的生殖更新情况分析表明,黄土高原丘陵沟壑区狼牙刺天然林群落不同生境条件下物种多样性指数大致呈阳坡下部﹥阴坡下部﹥阳坡上部的趋势;有性生殖表现为阳坡下部(883/标准株)﹥阳坡上部(875/标准株)﹥阴坡下部(746/标准株);其无性生殖潜力表现为:阳坡上部(0.722)﹥阳坡下部(0.625)﹥阴坡下部(0.444)。狼牙刺在阳坡上部能够通过无性繁殖进行良好的自我更新,且无性繁殖较旺盛,幼龄个体较多,相比较而言,在阴坡下部狼牙刺种群的更新情况较阳坡上部差,无性苗数量少,扩散范围小,虽然水分条件良好,但是狼牙刺是耐旱性物种,对其影响不大。因此确定狼牙刺种群在黄土高原丘陵沟壑区的适生范围为阳坡上部。3.通过对刺槐和狼牙刺种群各个指标的综合比较分析表明,在黄土高原丘陵沟壑区狼牙刺天然林能够良好的自我更新繁殖,而刺槐人工林只能在阴坡下部和沟谷等地能进行种群的繁衍,要想使其人工林天然化,更要注意外界环境干扰和人工抚育等措施的影响。4.黄土高原丘陵沟壑区在未来植被恢复和重建的过程中,要优先考虑当地的乡土树种,有利于尽快恢复植被;对应有的天然林群落要进行封禁,使其盖度进一步增加,促进群落生态效益进一步发挥。对应有的人工林群落要进行适当的改造抚育,防止出现群落衰退现象和造林失败。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2008-06-01）
生殖与更新论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的:探讨CG5033基因在果蝇睾丸中对生殖干细胞自我更新和分化过程的影响。方法:采用UAS/Gal4系统驱动果蝇睾丸生殖干细胞(nos-Gal4)、分化的精原细胞(bam-Gal4)和包囊细胞(tj-Gal4)中UAS-CG5033 RNAi的表达。在F1代果蝇中挑选单只nos>CG5033 RNAi、bam>CG5033 RNAi及tj>CG5033 RNAi基因型成年雄蝇,与3只野生型处女蝇杂交,观察是否可获得后代果蝇;通过光学显微镜和免疫荧光染色方法观察野生型和CG5033 RNAi雄性果蝇睾丸中Vasa、眼缺陷蛋白(eyes absent,Eya)、DE-cad、锌指结构域1蛋白(Zn finger homeodomain 1,Zfh1)和1B1的表达模式。结果:与野生型果蝇组比较,nos>CG5033 RNAi组和tj>CG5033 RNAi组果蝇呈雄性不育,而bam>CG5033 RNAi果蝇组生育率未受影响。光学显微镜下,与野生型果蝇组比较,用nos-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi雄性果蝇的睾丸明显变小。免疫荧光染色结果表明,与野生型果蝇组比较,用nos-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi的雄性果蝇睾丸中的生殖细胞消失,包囊细胞代偿性增多,而用tj-Gal4驱动UAS-CG5033 RNAi的果蝇睾丸中出现生殖细胞肿瘤;bam>CG5033 RNAi睾丸未见明显异常。结论:CG5033基因编码的蛋白在果蝇睾丸生殖干细胞中影响细胞的自我更新能力,并可通过体细胞干细胞影响生殖干细胞的分化过程,最终导致生殖细胞肿瘤的形成。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
生殖与更新论文参考文献
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[3].翟源心,郑丽明,华进联.E-cadherin对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新与增殖的影响[J].农业生物技术学报.2016
[4].武思宇.深度测序法筛选和鉴定维持奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的关键因子[D].西北农林科技大学.2016
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[8].宋文聪.miR-544靶向PLZF调控奶山羊雄性生殖干细胞的自我更新[D].西北农林科技大学.2014
[9].孙军伟.GDNF对奶山羊雄性生殖干细胞自我更新的调控[D].西北农林科技大学.2011
[10].张长庆.黄土高原丘陵沟壑区刺槐人工林和狼牙刺天然林生殖与更新研究[D].西北农林科技大学.2008