酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2的发酵工艺研究

论文摘要

脂肪酶（EC3.1.1.3）是一种酯键水解酶,能将长链脂肪酸甘油酯水解成长链脂肪酸和甘油。脂肪酶广泛应用于生物能源、食品加工等领域。近年来,由于能源危机促使人们更关注生物能源的开发,生物柴油是理想的生物能源品种,尽管化学法制备工艺已工业化,但存在产品分离困难、能耗高及“二次”污染等缺点。酶法制备生物柴油工艺则能克服上述不足,是今后生物柴油制备工艺的发展方向。游离脂肪酶稳定性差,催化过程中易失活,且不能重复回收利用,造成生产成本高,制约着其产业化发展。全细胞催化剂可改善稳定性、催化活性和回收使用性。本研究在前期工作基础上,对酿酒酵母细胞表面展示解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶Lip2的发酵条件进行系统研究与优化。主要结果如下:1.研究表面展示Y. lipolytica脂肪酶Lip2基本酶学特性。比较反应温度、pH、和底物对表面展示的Y. lipolytica脂肪酶Lip2酶活的影响。结果表明,表面展示的Y. lipolytica脂肪酶Lip2的最适温度为40°C,最适pH为8.0,最适底物为C8。2.研究酿酒酵母细胞表面展示Y. lipolytica脂肪酶Lip2的发酵工艺参数的单因素试验。考察摇床转速、装液量、诱导时间、半乳糖含量、YNB含量、接种量、诱导温度、氮源等因素对展示酶LIP2发酵生产的影响。实验表明,在研究范围内,最佳发酵工艺参数为:装液量40 mL,诱导时间72 h,诱导温度20°C,半乳糖含量1.5%（w/v）,接种量4%,最佳氮源为YNB。3.在单因子实验的基础上,通过响应面优化上述工艺参数,酶活可进一步增大。首先,采用Plackett-Burman实验设计对7个影响表面展示脂肪酶酶活的可能因素进行筛选。实验结果表明,酸水解酪蛋白（Casein acid hydrolysate,CAA）和半乳糖是2个影响表面展示脂肪酶酶活的主效因子。然后,以最陡爬坡实验设计,逼近主效因子的最大产酶区域。共进行6次实验。实验结果表明,最大产酶区在第4次实验（RUN4）附近。最后,采用响应面分析法确定显著因子的最优水平。结果表明,最优培养基组成为:5.40 g Na2HPO4,7.45 g NaH2PO4,15.029 g CAA,加水至800 mL,pH 7.0,0.1 MPa高压下蒸汽灭菌20 min,冷却后加13.4% （w/v）YNB溶液100 mL,13.821% （w/v）半乳糖溶液100 mL。最优发酵培养条件为:接种量为液体培养基体积的10%;初始pH为7.0;转速为150 r/min;装液量为30 mL。此条件下发酵,可获得最大酶活1400.39 U/g-干细胞。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酶综述
• 1.2 酶法催化制备生物柴油现状
• 1.3 表面展示技术制备全细胞生物催化剂及其应用
• 1.4 影响表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2 的酿酒酵母发酵生产的主要因素
• 1.5 课题来源、目的和意义
• 2 酿酒酵母细胞展示脂肪酶Lip2 的酶学特性研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与分析
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 3 酿酒酵母细胞展示脂肪酶Lip2 的发酵工艺参数探讨
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 4 响应面法优化发酵培养基和发酵条件
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 5 全文总结与展望
• 5.1 全文总结
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 缩写词