论文摘要
地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum（E Perrier）、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris（Chen）、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi（Michaelsen）或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera（Michaelsen）的干燥体。前一种习称“广地龙”,后三种习称“沪地龙”,为常用动物类中药,具有清热定惊,通络平喘,利尿的功效。现代研究表明,地龙具有降压、抗血栓、抗心律失常、抗癌、抗溃疡、解热镇痛、镇静、平喘、抗菌等多种药理作用,几乎涉及人体各个系统,因此近年来地龙的需求量与日俱增。长期以来地龙类药用动物处于自然生长状态,药材来源多为野生采集,人工养殖尚未较大规模开展,地龙药材的产量和质量易受采集方法、环境以及自然气候影响而不定。且由于地龙类药用原动物品种较多,尚缺乏真实有效的鉴别方法,经常出现误采误收的现象,导致各地市场上的广地龙药材品种混杂,价格变化较大,药材品质优劣参差不齐等问题,极大地影响了地龙的生产与发展。为了确保地龙资源的可持续发展与利用,我们在广东省惠州市博罗县建立了地龙（参环毛蚓）规范化养殖基地,并在此基础上对现有地龙的资源种类、分布进行调查,研究了其生物学特性、遗传多样性和地理背景系统,建立药材综合品质评价指标。研究的结果概括如下:一、文献综述查阅了大量与本研究相关的国内外文献资料,系统的总结了前人的研究成果与存在的问题,针对地龙药材资源与鉴定、药材质量控制与评价、安全性研究等方面存在的薄弱环节提出了本论文的研究内容与目标。二、地龙类药用动物的种质资源调查对地龙药材进行了药源调查和分类学研究,结果表明:地龙全国均有分布,广东、广西为“广地龙”药材主要产区;上海、浙江、江苏为“沪地龙”主要产区;其余各地习用品种为“土地龙”。全国地龙主要商品来源为“广地龙”。我国地龙药材的原动物主要有14种和变种,分别隶属于钜蚓科、正蚓科的3个属。三、地龙类药用动物的物种鉴别通过实地捕捉或委托采集的方式收集到国内地龙主要产区的16个不同地点的蚯蚓样品共351条,利用经典动物分类学方法对所收集的样本进行鉴别,发现广东省主要分布着参环毛蚓Pheretima.aspergillum（E Perrier）,其中也少量分布有白颈环毛蚓P.californica（Kinberg）和壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）;广西地区除了分布有参环毛蚓aspergillum（E Perrier）外,还分布有数量均比较多的通俗环毛蚓P.vulgaris（Chen）和白颈环毛蚓P.californica（Kinberg）,以及少量的威廉环毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）和壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）;湖北省主要为背暗异唇蚓Allolbophora caliginoa erapezoides（Ant.Duges）,赤子爱胜蚓Eiseniafoetida（Savigny）,通俗环毛蚓P.vulgaris（Chen）以及少量的威廉环毛蚓P.guillelmi（Michaelsen）;福建省则分布着较多的壮伟环毛蚓P.robusta（E.Perrier）。进一步证实了广东与广西为广地龙（参环毛蚓）的主要产区。比较了样品不同处理保存方法的优缺点,建议用于性状鉴别的标本,采用福尔马林保存;用于理化分析样品可直接晒干保存;用于分子生物学实验,需提取基因组DNA的原动物样品,应迅速定种后用少量70%乙醇或者生理盐水浸泡,密封在试管中,—20℃冻存。使用体视镜对样品的体表特征以及内部构造的观察,并与相关标准文献进行比较的性状鉴别方法,基本都可以准确的对样品进行鉴别定种,获得相关的种质资源分布状况。根据研究的结果,为便于快速准确的对药用蚯蚓进行鉴别分类,我们编制了14种地龙原动物的分种检索表和分种检索图。本研究结果表明,采用传统分类学指标,可较方便地对形态特征保存完好地蚯蚓样品进行鉴别分类。四、地龙类药用动物的ISSR分子鉴定研究利用ISSR分子标记技术对地龙不同种质资源进行了DNA水平的分子鉴定研究。以筛选到的8个ISSR引物对供试的7个样品进行ISSR-PCR扩增,共扩增出137条带,其中多态性条带有127条,占92.7%;利用NTSYSpc-2.10e软件对ISSR表型数据矩阵进行聚类分析,用SimQual程序求Nei-Li相似系数矩阵,探讨其亲缘关系。种质间相似系数最小为0.43;最大的为0.66,说明地龙种质的遗传多样性较为丰富。聚类分析结果表明,供试材料在相似系数为0.56处分为4个类群,第Ⅲ类群和第Ⅳ类群中各种质之间的亲缘关系较近,而第Ⅰ类群与第Ⅱ类群亲缘关系较远,同属蚯蚓内个体间的亲缘关系较近,不同属间个体的遗传距离较远。这与它们在形态鉴别分类上的结果相一致。五、地龙药材的多组分的含量测定以及HPLC指纹图谱研究（一）HPLC法测定地龙中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量本研究测定了不同产地地龙药材中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷的含量,建立了广地龙质量控制的客观指标。方法:用0.9%生理盐水超声提取地龙药材,采用反相高效液相色谱法,以0.01mol/L磷酸二氢钾溶液和50%甲醇为流动相,梯度洗脱,检测波长254nm,柱温27℃,进样量10μl,可同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷等4种成分的含量。结果:尿嘧啶的线性范围为0.0075-0.24μg（r=0.9993）,平均回收率99.82%,RSD为2.34%;次黄嘌呤的线性范围0.0250-0.8μg（r=0.9992）,平均回收率101.93%,RSD为1.45%;尿苷的线性范围0.0125-0.4μg（r=0.9992）,平均回收率97.53%,RSD为1.73%;肌苷的线性范围0.0500-1.6μg（r=0.9991）,平均回收率102.06%,RSD为2.44%。该方法重现性,回收率较好,可用于广地龙尿嘧啶等4种成分的含量测定。（二）地龙水溶性成分的指纹图谱研究建立了地龙水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱,旨在反映地龙内在化学信息,全面评价地龙的质量。采用高效液相色谱法,梯度洗脱,对17份地龙样品测定,以主要的11个共有峰的相对保留时间和相对峰面积作为地龙指纹图谱的相关技术参数,得出的11个主要共有峰的相对保留时间重现性好,相对峰面积有明显差别,对获取的指纹图谱数据进行相似度分析,建立了地龙的指纹图谱,可用于地龙的鉴别和质量的评价。运用SPSS分析软件对所采集图谱数据进行了聚类分析,采用离差平方和法,利用欧氏距离作为样品的测度。17个样品基本分为四大类。从聚类结果来看,广东、广西产地的地龙药材,亲缘关系较近,所含化学成分及其比值比较相似;海南产地药材比较相似;而沪地龙的亲缘关系和化学成分则与它们明显区分开来。这也印证了不同产地,不同品种的地龙药材所含的化学成分存在一定的差异。故在生产中建议固定品种和产地。六、地龙中重金属及有害元素的检测采用紫外分光光度法测定了地龙中重金属的含量,分析波长215nm。标准曲线的回归方程为:y=0.7231x+0.043,相关系数R2=0.9968,结果表明检测质量分数在0～50μg/g范围内具有良好的线性关系。平均加样回收率为99.97%。该法简便、快速、重现性好,能在一次操作中测出中药中大部分重金属的含量。适用地龙药材实际生产中重金属的检测。对9批地龙药材测定结果表明,各样品中重金属元素含量差异较大,且大都超出《中华人民共和国药典》2005版一部附录ⅨE规定的应不超过百万分之三十。地龙药材中的重金属超标问题值得我们关注。七、生态环境与地龙药材品质的相关性研究（一）地龙生态环境因子的考察与分析对道地药材广地龙主要产区的分布和环境情况进行了调查,并采集了广地龙产区以及非道地药材产区11个土壤样本,拟通过对广地龙主要产区的生态环境的调查和生长土壤（水分、DH值、重金属等）的分析,以考察与地龙质量相关的环境因子,了解其产地适宜性,为广地龙的规范化养殖提供理论上的支持。地龙产区的环境因子考察结果表明:广东、广西、福建、海南四个省份地处中国东部沿海,气候、地势条件优越,适合广地龙生长发育。产区土壤样品测试分析结果表明:含水量为25%左右的土壤较适合参环毛蚓生存。其生长发育的最适pH值为6.8～7.6。广地龙（参环毛蚓）能够在砷（4.929-16.000mg/kg）、镉（0.999-8.604mg/kg）、铬（26.830-110.168mg/kg）、铜（44.900-349.356mg/kg）、镍（94.400-480.088mg/kg）、铅（15.084-114.715mg/kg）、锌（11.163-601.859mg/kg）含量范围的土壤中生存,对土壤重金属的耐受性与其他蚓种相似。地龙产区工业发展与药材的质量优劣有重要关联。工业发展向环境中排放的重金属越多,对该产区的地龙药材的质量下降值影响越大。（二）地龙中重金属含量与环境的相关性研究1.广地龙对重金属富集动力学特性研究本实验应用半静态条件下的双箱动力学模型,将不同浓度重金属条件下养殖过的参环毛蚓经浓硝酸—过氧化氢低温消解处理后测定重金属含量,探讨参环毛蚓对土壤中Cd、Hg、Pb三种重金属离子的生物富集规律。结果:地龙在Pb高、中、低浓度的富集速率分别为k1=1.232,K2=1.325,K3=1.058;对Cd的高、中、低浓度富集速率分别为k1=0.1792,K2=0.1753,K3=0.1382;对Hg的富集呈现出波动性。结论:广地龙从土壤中富集Pb的能力明显高于Cd,且随着时间的推移而增大;对Hg的富集作用是先快速吸收,积累到一定浓度时,再快速排出,而后再度吸收。2.重金属对参环毛蚓金属硫蛋白wMT诱导机制研究金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类存在于生物体内的低分子量、富含半胱氨酸（Cys）、能被金属诱导表达的金属结合蛋白。蚯蚓体内因存在特殊的金属硫蛋白（wMT）,对土壤中的重金属有富集作用,导致体内重金属元素含量较高。本实验通过对参环毛蚓进行不同重金属诱导30天后,提取wMT蛋白,采用银饱和分析法,结合原子吸收ASS对蚯蚓体内wMT的含量进行测定。以探讨重金属诱导参环毛蚓wMT的有关机制。初步分析得出参环毛蚓体内wMT含量受到不同重金属的诱导影响,大小依次为:Cu＞Cd＞Zn＞Pb;且总的看来内脏中含有的wMT含量高于肌肉中,这也表明wMT主要在蚯蚓的内脏中表达。八、地龙药材的质量标准研究在大量实验性研究和检测的基础上,对《中华人民共和国药典》（一部,2005年版）有关“地龙”的药材质量标准作了部分修订。增加了地龙药材的含量测定项,选择次黄嘌呤和肌苷作为地龙药材含量测定的指标,规定本品按干燥品计算,含次黄嘌呤不得少于0.2 mg/g;含肌苷不得少于0.3 mg/g。另对性状、炮制等项进行了补充。产地加工方法中添加“除去两头所带泥土”;性状项增加了“除前后两端外,腹部已经剖开,内脏除去或偶有残留”的描述。炮制项建议添加“除去杂质和体内泥沙”。本研究建立了地龙药材的含量测定方法,完善了质量标准,为地龙药材的较全面的质量控制提供依据。九、结论与展望本论文对地龙种质的多样性进行了较为系统的研究,这为种质资源的进一步利用提供了参考。研究建立了地龙药材多组分含量测定方法和HPLC的指纹图谱,以及地龙药材重金属含量的紫外分光光度测定法,完善了地龙药材的质量指标体系,为药材的质量控制提供了依据。对地龙药材质量与生态环境因子的关系进行了研究,为改善地龙种质和药材质量提供了借鉴。其中地龙重金属富集以及WMT蛋白诱导机制等工作还可做进一步的探讨和研究。