衍生自枯草芽孢杆菌MrpF的疏水多肽对蛋白膜锚定的研究

论文摘要

本研究研利用一种枯草芽孢杆菌膜蛋白MrpF作为膜锚定分子,锚定一些亲水性蛋白到大肠杆菌细胞膜表面,本研究中选定了一种较为常用,稳定且活性易于检测的亲水性蛋白PhoA来锚定。首先利用计算机预测了MrpF的结构和疏水性。得出MrpF一种三次跨膜的膜蛋白依据计算机预测的结构,设计了PhoA-MrpF融合蛋白。通过基因克隆的方法从大肠杆菌内克隆出phoA基因,然后通过基因融合的方法,将phoA基因融合于mrpF基因上游,构建出PhoA-MrpF融合蛋白的基因,再导入大肠杆菌诱导其表达。表达结果显示融合蛋白表达良好,PhoA显示出较高的酶活性。且在融合MrpF后,PhoA即被锚定在MrpF上。这一结果证明MrpF可以将PhoA锚定于细胞膜同时不会明显影响PhoA的表达和活性。在此基础上,对MrpF进行截短改造。当MrpF截至一个跨膜螺旋结构域后,PhoA仍能表现出高度的活性,并且锚定于细胞膜。对MrpF进一步截短,研究其能够实现PhoA膜锚定的最短长度。为检测PhoA锚定于细胞膜的效率,发展了一些细胞处理和酶活检测方法。一种是采用溶菌酶直接消化掉细胞壁,EDTA使外膜解体,从而使细胞周质的PhoA直接暴露出来,游离的PhoA将被洗脱掉,锚地在膜上的PhoA则依然在细胞上从而被检测到。另一种方法是渗透压法（osmotic shock）。这种方法能够将周质蛋白从周质释放出,但是如果PhoA被锚定在膜上,就不会被释放。这两种方法各自独立,互相映证。在计算机预测的基础上,构建出了一系列截短的MrpF与碱性磷酸酶的融合蛋白。然后导入大肠杆菌诱导表达。利用上述方法检测其膜定位效率。研究结果指出,能实现PhoA膜定位的最短疏水标签长度为8个氨基酸。本研究的结论可以从两个方面阐述其意义。一是从理论方面,细胞蛋白跨膜转运机制一直是生命科学研究的一个难题,到目前为止还没有一个明确的理论解释蛋白的跨膜转运,膜蛋白的膜插入等机制,本研究得出了一个最短的膜锚定疏水多肽长度,提示这个长度可能是蛋白转运中被识别的最短的终止转运序列,为这一类研究提供了部分证据。二是从应用方面,周质锚定表达技术（APEx）在抗体筛选,蛋白表达等方面有广泛应用。本研究的出的结论可为这一技术中膜锚定蛋白的设计和选择提供参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第1章 引言
• 1.1 膜蛋白和蛋白质的细胞膜定位
• 1.2 枯草芽孢杆菌蛋白MrpF
• 1.3 大肠杆菌碱性磷酸酶PhoA
• 1.3.1 PhoA的结构
• 1.3.2 PhoA的生理功能及应用
• 1.4 跨膜蛋白转运机制
• 1.4.1 膜蛋白的转运和插入机制
• 1.4.2 跨膜螺旋
• 1.5 膜定位与展示技术
• 1.6 课题研究的目的和意义
• 1.7 课题研究内容和方案
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 实验仪器
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 实验中用到的PCR引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR
• 2.2.2 质粒提取
• 2.2.3 氯化钙法制备感受态细胞
• 2.2.4 pYC[phoA-mrpF]融合载体的构建
• 2.2.5 pYC[phoA-tags]融合载体的构建
• 2.2.6 利用软件对MrpF进行细胞定位、疏水性及拓扑结构分析
• 2.2.7 pYC[phoA-mrpF]融合载体的修饰改造
• 2.2.8 重组蛋白的诱导表达
• 2.2.9 细胞膜的提取
• 2.2.10 细胞PhoA酶活检测
• 2.2.11 细胞膜PhoA酶活检测
• 第3章 枯草芽孢杆菌蛋白MrpF生物信息学分析
• 3.1 mrpF基因序列
• 3.2 MrpF蛋白的细胞定位、疏水性及拓扑结构预测分析
• 3.2.1 MrpF的细胞定位分析
• 3.2.2 MrpF疏水性分析
• 3.2.3 MrpF拓扑结构分析
• 3.2.4 疏水标签的疏水性分析
• 3.3 小结
• 第4章 疏水标签的设计和表达载体构建
• 4.1 疏水标签的设计
• 4.2 表达载体构建
• 4.2.1 pYC[phoA-mrpF]融合载体的构建
• 4.2.2 pYC[phoA-tags]融合载体的构建
• 4.3 小结
• 第5章 融合蛋白的表达与活性检测
• 5.1 融合蛋白PhoA-MrpF的表达
• 5.2 融合疏水标签的PhoA表达
• 5.2.1 细菌生长状况
• 5.2.2 细胞PhoA酶活性
• 5.2.3 融合蛋白的SDS-PAGE电泳检测
• 5.3 小结
• 第6章 融合蛋白的膜锚定
• 6.1 细胞渗透压处理后PhoA检测
• 6.1.1 酶活检测
• 6.1.2 SDS-PAGE电泳分析
• 6.2 细菌溶菌酶处理后PhoA检测
• 6.2.1 酶活检测
• 6.2.2 SDS-PAGE电泳分析
• 6.3 细胞膜提取物PhoA检测
• 6.3.1 细胞膜酶活检测
• 6.3.2 细胞膜SDS-PAGE电泳
• 6.4 小结
• 第7章 结果与讨论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间获得与学位论文相关的科研成果目录