论文摘要
转基因动物是指通过人工的方法将外源基因导入动物染色体基因组,使之稳定表达并能遗传给后代的一类动物。随着技术的进步,转基因动物在医学、生命科学、生物制药等领域都有着广泛的研究和应用前景,因此科学家们一直在探索一种更简便易行、经济实用而又高效的转基因方法。近年来,体内基因转移已成为用于基因治疗、生物学分析等领域非常受欢迎的一种技术。脂质体是一种新型的转染介质,可以通过细胞的内吞或吞噬作用,将所携带的目标基因导入细胞中。因其对细胞毒性低,对转染的核酸类型和分子量有很高的包容性;且易于制备、免疫原性低、转染操作简单,故应用范围越来越广泛,不仅用于瞬时转染,也可用于永久表达系的建立。精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）是位于睾丸曲细精管基膜上既能自增殖维持自身群体恒定,又能定向分化产生分化型精原细胞的雄性生殖系干细胞,其自增殖过程几乎可以贯穿机体的整个生命而又兼有向子代传递遗传信息的能力。为了探讨在体睾丸曲精细管内注射法制备转基因动物的可行性,首先摸索了小鼠精原干细胞体外培养细胞形态及培养条件。转染液采用脂质体包裹绿色荧光蛋白报告基因pIRES-EGFP质粒。为筛选最佳转染效果,采用不同配比的pIRES-EGFP质粒与脂质体组成转染试剂,分别在转染后不同时间点荧光显微镜下观察细胞活力与转染率。结果显示与支持细胞共培养能促进SSCs的存活和增殖,通过饲养层细胞辅助培养是体外培养SSCs较好的手段。脂质体Lipofectamine2000浓度高,对细胞有毒性作用,浓度低,转染效率低。通过细胞活力计数,筛选出转染液中DNA与脂质体Lipofectamine2000的最佳配比为2μg:5μl。在转染后36h,细胞转染率最高,达到31.5%。在细胞实验的基础上,对小鼠进行睾丸内注射。A组小鼠进行外科手术,在体视显微镜下对小鼠曲精细管进行注射,转染液混有1%台盼蓝,起指示作用。每个睾丸选23个注射点,使睾丸表面约30%以上的曲细精管变蓝,考虑到小鼠睾丸的容积,每只小鼠的注射量为40μl。B组小鼠不进行外科手术,采用多点多次注射方式,直接进行睾丸注射,每三天注射一次,共进行三次注射,每只小鼠每次注射量为40μl。PCR结果显示A组F1代转基因阳性率31.4%,F2代转基因阳性率11.7%,B组F1代转基因阳性率17.1%,F2代转基因阳性率12.5%。证实曲精细管注射法可成功制备转基因动物,转基因效率较高。无须外科手术,通过直接睾丸多点多次反复注射,证实可成功制备含有外源基因的转基因后代,这为大型家畜的转基因技术开辟了一条新途径。