论文摘要
微孢子虫（Microsporidia）是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物,几乎寄生于整个动物界,包括感染人类,也是蚕桑业和渔业等的常见病害。近来许多研究揭示病原体的表面蛋白在对宿主的感染、入侵以及致病过程中扮演着重要的角色,如疟原虫子孢子和裂殖体表面蛋白可作为配体与靶细胞表面受体结合并参与入侵。关于微孢子虫,最近的研究报道,脑胞内原虫属（Encephalitozoon）孢子的孢壁蛋白能够通过其肝素结合基序识别并结合宿主细胞表面的葡聚糖,进而参与孢子粘附和宿主感染过程。而且,这种粘附机制能够增加宿主的感染率。但是,由于孢壁蛋白难以分离、序列同源性极低以及可利用的基因信息相对较少等特点,有效分离和鉴定孢壁蛋白的工作相当困难。迄今为止,被报到完整基因序列的孢壁蛋白仅11种,其中8种来源于脑孢内原虫属微孢子虫,3种来自家蚕微孢子虫。本研究首先进行家蚕微孢子虫单克隆抗体的研制、针对家蚕微孢子虫孢壁蛋白的抗体的筛选,然后,采用免疫沉淀-蛋白印迹-质谱技术分离鉴定出该单克隆抗体的靶蛋白,并对其编码序列进行体外分子克隆、原核表达,对蛋白质进行免疫电镜表达定位分析以及蛋白质氨基酸序列的生物学信息分析,最后对其中的一种孢壁蛋白SWP26的功能进行研究,并初步探讨了SWP26与宿主中肠蛋白质的相互作用关系。主要研究结果如下:1.家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体的制备和鉴定用家蚕微孢子虫总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）的杂交瘤细胞株,分别命名为2G10和2B10。然后,采用间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence test,IFAT）和蛋白印迹（Western blot）两种方法对单抗特异性进行了鉴定,两者结果基本上一致。IFAT结果显示单抗2G10试验中,纯化的正常微孢子发出明亮的翠绿色荧光,而在用SDS提取了孢壁蛋白的样品中孢子呈现弱荧光,这说明了该抗体可能与家蚕微孢子虫的一种或几种孢壁蛋白发生反应;而单抗2B10的IFAT试验中,没有经SDS处理的纯化的孢子中没有检测到任何荧光,在SDS处理后的样品中却检测到了明亮的翠绿色荧光,这表明该抗体能识别孢内壁蛋白抗原或者质膜上蛋白抗原。此外,Western blot分析显示,在SDS法提取的孢壁蛋白中,单抗2G10识别一条分子量约为26 kDa蛋白质条带,这表明该抗体能识别孢壁上蛋白质;同时,在发芽速冻法提取的孢子总蛋白中则识别3条大小不同的蛋白质条带,大小分别是76,54和26 kDa。蛋白印迹试验结果表明单抗2G10可以与3种不同的孢子蛋白质发生杂交反应,其一为孢壁蛋白SWP26。同样地,我们对单抗2B10进行了类似的分析,发现单抗2B10在SDS法提取的蛋白质和发芽速冻法提取的孢子总蛋白中都只与1种蛋白有杂交信号,说明该抗体只能识别一种蛋白质,且该蛋白质可能是一种孢壁蛋白。该实验表明通过制备和筛选家蚕微孢子孢壁蛋白单克隆抗体可为家蚕微孢子虫孢壁蛋白的研究提供靶标,同时为快速检测家蚕微孢子虫提供合适的免疫试剂。2.家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体靶蛋白的分离与质谱鉴定分析利用前章制备获得的家蚕微孢子虫孢壁蛋白质单克隆抗体,采用免疫沉淀-蛋白印迹-质谱方法从家蚕微孢子虫孢子总裂解蛋白中分离、富集和鉴定相应的靶蛋白。首先,我们采用免疫沉淀的方法分离和纯化抗原抗体复合物中的靶蛋白。用家蚕微孢子虫孢壁蛋白单克隆抗体2G10与处理过的成熟孢子细胞裂解液反应,洗脱收集样品进行SDS-PAGE分析和Western blot分析,发现在接近76、54和26 kDa的位置处有免疫沉淀分离出的蛋白条带,切取的蛋白条带进行MALDI-TOF-MS鉴定。用Mascot软件或GPMAW6.10软件查询本地家蚕微孢子虫蛋白质数据库,统计最佳匹配检索结果,质谱鉴定结果如下:76 kDa蛋白条带为热激相关的70 kDa蛋白（Heat shock related 70 kDa protein）;54 kDa蛋白条带为延长因子1a（elongationfactor 1 alpha）;26 kDa蛋白条带为假设蛋白（Hypothetical protein,即是在进一步试验中所鉴定的孢壁蛋白SWP26）。同样地,我们对单抗2B10的靶蛋白进行分离鉴定,获得了一条大小约55 kDa的蛋白质条带,质谱鉴定分析表明是一种新的未知蛋白。通过本章的研究,我们成功的获得了孢壁蛋白单克隆抗体相应的抗原蛋白,为孢壁蛋白的进一步鉴定打下了基础。同时,免疫沉淀-蛋白印迹-质谱这一技术路线简单易行,为孢壁蛋白质的分离筛选提供了新思路和新方法。3.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP26基因的克隆分析及原核表达本研究在家蚕微孢子虫基因组数据的基础上,对前章试验分离获得的大小为约为26 kDa的假定孢壁蛋白的编码序列进行克隆、序列分析以及原核表达研究。首先,在体外成功地克隆了蛋白编码基因,基因大小为672 bp,编码223个氨基酸。氨基酸序列分析表明该蛋白具有一个N-信号肽和一个C-端肝素结合基序,这暗示该蛋白是一种分泌型蛋白并且可能利用C-端肝素结合基序参与孢子的粘附。因此,分别设计针对具有肝素结合基序的SWP26和去除肝素结合基序的ΔSWP26的不同表达引物、构建原核表达载体pGEX4T/SWP26,然后在大肠杆菌中诱导表达。利用His-Tag柱纯化表达产物,为孢壁蛋白SWP26的功能研究做准备。同时,将纯化的表达产物免疫小鼠,制备抗血清,并进行Western blot分析,在家蚕微孢子虫总蛋白中检测到了特异的、分子量大小与预测一致的蛋白质条带。试验结果表明所制备的抗血清可以用于孢壁蛋白SWP26的进一步体内表达定位研究,也支持了前面研究中免疫沉淀-蛋白印迹-质谱鉴定方法的可靠性和结果的正确性。4.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP26的定位研究本研究采用间接免疫荧光试验和免疫电镜技术对假定的孢壁蛋白SWP26和孢壁蛋白单抗2B10靶蛋白的体内表达特异性和亚细胞定位特点进行了研究。利用抗孢壁蛋白SWP26的多克隆抗体对孢壁蛋白SWP26进行了亚细胞定位分析,免疫电镜结果揭示该蛋白是一种孢壁蛋白。特别是在孢子内壁的发育过程中,在未成熟孢子里,有大量的该蛋白累积在靠近质膜侧的孢原质空间里,也分布在正在发育的孢子内壁上。而在成熟孢子里,孢子的外壁和内壁上都有少量表达,孢原质里则没有该蛋白质的分布,这与成熟孢子虫的间接免疫荧光试验结果一致。同样地,对单抗2B10的靶蛋白进行了亚细胞定位分析。超薄切片免疫电镜表明,单抗2B10的靶蛋白是一种在孢子的整个胞内发育中都分泌表达的蛋白质,是一种与孢子内壁发育相关的蛋白质。在卵块发育阶段,大量的靶蛋白主要分布在各种不同发育阶段的细胞的孢原质空间里,而且随着细胞质膜层的加厚,靶蛋白表达量增加。在孢子增殖阶段,该靶蛋白大量的累积在发育的孢子内壁上。更为显著地是,随着孢子壁的形成,定位在孢子内壁上的靶蛋白增多而孢原质空间减少。在成熟孢子里,仅有少量的靶蛋白分布在孢子内壁上,这与成熟孢子的间接免疫荧光试验结果一致。总之,本研究通过对孢壁蛋白的鉴定,一定程度上丰富了对于孢壁蛋白的组成的认识,也将有利于对孢壁蛋白的生物合成的研究,有利于对于微孢子虫生物学过程的理解,进而为控制微粒子病提供新的药物设计靶标和诊断依据。5.家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP26的功能初探本研究利用外源重组表达蛋白质（具有肝素结合基序的rSWP26和去掉肝素结合基序的rΔSWP26）与对照蛋白质GST分别进行体外宿主结合分析、细胞水平上的孢子粘附与感染分析以及互作的宿主靶蛋白的分离鉴定研究,从而一定程度上揭示孢壁蛋白SWP26的功能,以此探讨该寄生虫与宿主的相互作用。首先,将表达的重组蛋白SWP26（rSWP26和rΔSWP26）分别与宿主细胞-家蚕胚胎细胞系BmN-SWU1体外共孵育,然后将宿主细胞收集、裂解,最后进行免疫印迹分析,结果表明外源重组表达蛋白rSWP26能够直接结合到宿主细胞表面,而去除肝素结合基序的外源融合蛋白rΔSWP26则没有结合。其次,利用表达的重组蛋白rSWP26、突变体重组蛋白rΔSWP26和对照蛋白GST分别作为抑制剂进行体外的孢子粘附试验,研究结果显示:当用1mL的5μg/mL重组蛋白rSWP26处理时,孢子粘附相对抑制率达到最大约为10%;突变体重组蛋白rΔSWP26和对照蛋白GST一样没有任何影响。这些结果表明具有肝素结合基序的外源重组表达蛋白rSWP26能够减少孢子的粘附率,但是阻断效果不显著;而外源重组表达蛋白rΔSWP26因去除肝素结合基序而失去抑制作用。这暗示该序列基序在蛋白质-葡聚糖相互作用中可能发挥着重要作用。此外,利用外源蛋白作为抑制剂验证了孢子粘附与宿主细胞感染之间存在直接的关系。然而,在孢子粘附和宿主感染试验中,外源的孢壁蛋白rSWP26的抑制作用并不明显。以上试验,在细胞水平上证实了孢壁蛋白SWP26能够直接与宿主蛋白质进行相互作用。最后,以该重组融合蛋白rSWP26为诱饵蛋白,采用GST沉淀试验（GST-pull down）分离互作的靶蛋白,然后利用质谱技术进行鉴定,结果初步获得了5个假定的互作的靶蛋白-宿主（家蚕）蛋白质。总之,通过本章的研究,我们了解到孢壁蛋白SWP26能够识别并与宿主细胞表面蛋白发生相互作用,且作用机制也是相当复杂的。而有关孢壁蛋白与宿主蛋白的互作机制以及孢壁蛋白的具体生理功能等还有待于更深入的研究。本研究的开展为进一步鉴定孢壁蛋白相互作用蛋白质的功能奠定了基础。
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