抗呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体的研制及其ELISA检测方法的建立

论文摘要

呋喃西林（Nitrofural）是硝基呋喃类药物的一种。由于它以及其代谢物均具有很强的毒性和致癌副作用,已引起世界各国的高度重视。呋喃类物质在动物体内稳定性较差,而其代谢物与组织蛋白结合可以形成稳定的化合物,现在各国均禁止其在畜牧生产上应用,故对于呋喃类物质代谢物的研究和检测的意义就显得更为重要。目前呋喃西林代谢物的检测技术主要有色谱技术和免疫分析技术。色谱技术样品处理繁琐费时,成本高,而且需要有经过专门训练的专业人员来操作复杂的仪器设备,不适合大批量样品的筛选。作为一种快速、灵敏、特异的检测方法,酶联免疫吸附测定正逐渐应用于药物的残留检测。本研究通过衍生化抗原的合成和单克隆抗体技术,建立了能分泌呋喃西林代谢物衍生物单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并用单克隆抗体建立了检测呋喃西林代谢物残留的ELISA方法。首先将呋喃西林代谢物氨基脲（SEM）与对羧基苯甲醛（CBA）进行衍生化反应,使前者的氨基和后者的醛基发生共价反应生成弱碱Schiff碱,进而生成SEM衍生物（CPSEM）,通过红外扫描氨基特征吸收峰鉴定衍生物。然后将CPSEM与载体蛋白BSA反应,用活性酯法使前者的羧基和后者的氨基发生脱水缩合反应生成酰胺键,从而实现了半抗原与载体蛋白的偶连,通过紫外扫描280nm蛋白特征吸收峰鉴定偶连物。用合成的CPSEM人工抗原免疫Balb/c小鼠,并取其脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,通过酶联免疫吸附试验（ELISA）方法筛选,最终获得了3株能分泌抗呋喃西林代谢物衍生化抗原（CPSEM）单克隆抗体的杂交瘤细胞株。特异性试验证明单抗有很强的特异性,仅与试验的CPSEM,而不与CPAOZ、CPAHD、CBA,SEM等反应。用同样的方法将CPSEM与卵清蛋白偶连,将其作为包被抗原（CPSEM-OVA）,包被酶标板,CPSEM为竞争的半抗原,然后和待检样品与定量的抗CPSEM单克隆抗体反应,通过酶标抗体作用和底物显色,建立了间接竞争ELISA检测方法。实验结果表明,竞争ELISA最佳包被抗原浓度为8μg/ml,抗CPSEM-McAb最佳工作浓度为1:20000,酶标二抗的工作浓度为1:20000,可测最适范围为101000ng/mL,最小检测量为8ng/mL,CPSEM单抗对CPSEM的半数抑制浓度IC50为62.5ng/mL,批内和批间的变异系数分别为6.68%,5.02%。本研究结果为商品化试剂盒的组装奠定的了基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 文献综述
• 一、食品安全问题
• 二、硝基呋喃类药物的特性和毒性作用
• 研究一：呋喃西林代谢物衍生物人工抗原的合成与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 研究二：抗 CPSEM 单克隆抗体的研制
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 研究三：间接竞争 ELISA 检测 CPSEM 方法的建立
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 本研究主要成果
• 致谢