石榴果皮提取物抑菌活性研究

论文摘要

石榴（Punica granatum L．）为石榴科石榴属植物，原产于伊朗、阿富汗等中亚地区，西汉时引入中国，至今已有2000多年栽培历史。石榴果实具有很高的食用价值和药用价值，研究发现石榴具有抗氧化、抗癌、抗病毒、降血脂等多种生理活性功能。目前，对石榴果皮的生物活性研究主要集中在抗氧化活性方面，对其抑茵活性方面的研究相对较少，而从食品安全保藏学角度对其抑菌活性研究更是鲜见报道。本研究以石榴加工中的副产物——石榴果皮为试材，以食品中的常见污染菌为供试菌，以抑菌圈直径为活性追踪指标，对石榴果皮中抑菌活性物质提取的工艺条件、抑菌特性、抑菌机理及对冷却猪肉的保鲜作用进行了系统地研究，研究结果为石榴果皮工业化开发利用提供了理论和技术依据。主要研究结果如下：（1）对石榴果皮提取物抑菌活性初步研究结果表明，石榴果皮甲醇提取物的抑菌活性最高，对供试菌中细菌的抑制效果最好，其中对革兰氏阳性菌的抑制效果优于革兰氏阴性菌：对酵母菌的抑制效果较弱；对霉菌几乎没有抑制作用。对各供试菌的抑制效果依次为：金黄色葡萄球菌＞李斯特菌＞巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌＞沙门氏菌＞大肠杆菌＞解脂假丝酵母。（2）在供试的10个石榴品种中，‘峄城软籽’石榴果皮提取物的抑菌活性最高。石榴表果皮提取物的抑菌活性高于锥形横膜和萼筒的提取物。（3）在单因素试验的基础上，通过二次回归正交旋转组合设计进行提取工艺参数优化。结果表明，对石榴果皮抑菌活性物质提取效果影响的大小顺序为：乙醇浓度、提取温度、液固比、提取时间；其最佳提取工艺条件为：乙醇浓度60％，液固比10：1，提取温度60℃，提取时间4h。在此优化条件下，石榴果皮提取液抑菌圈直径为16．30mm。（4）抑菌试验结果表明，在优化条件下得到的石榴果皮提取物的抑菌谱与甲醇提取物相似，但活性更高；其对金黄色葡萄球菌的MIC、MBC分别为1．562 mg／mL、3．125mg／mL，抑菌活性与Nisin接近，而远高于苯甲酸钠和山梨酸钾。（5）石榴果皮提取物的抑菌活性具有较好的热稳定性，对紫外线照射和光照稳定；在介质pH6时活性最高；盐和糖对其抑菌活性具有一定的增效作用；Na+、Ca2+、K+、Fe2+、Fe3+均能提高石榴果皮提取物的抑菌活性，其中Fe2+的效果最为明显。（6）石榴果皮提取物经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取后，各萃取部分经抑菌活性比较，表明正丁醇部抑菌活性最高；对其化学成分分析结果表明抑菌活性物质主要为石榴多酚。采用硅胶柱层析法对正丁醇部进行进一步分离纯化，得到25个不同的部分；抑菌试验结果表明，几乎所有部分均具有一定的抑菌作用，但其活性均略低于正丁醇部，大部分与石榴果皮粗提物抑菌活性相近。（7）呼吸抑制试验结果表明，石榴果皮提取物主要是通过抑制HMP途径，导致还原力NADPH缺乏，引起代谢功能障碍，达到抑菌的目的；加药组和正常组金黄色葡萄球菌生长曲线的对比结果表明，石榴果皮提取物能够抑制金黄色葡萄球菌对数生长期的菌体分裂；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，石榴果皮提取物能够抑制菌细胞蛋白合成，尤其对菌体内大分子量蛋白作用最明显。通过扫描电镜、透射电镜观察，经石榴果皮提取物作用后菌体表面和内部结构均发生改变，细胞壁被破坏，出现质壁分离现象。综上所述，石榴果皮提取物的抑菌机理是其抑制了菌体的HMP途径，引起代谢功能障碍，使调控菌体生长、分裂相关蛋白的合成受到抑制，引起细胞质固缩，最终使菌体的生长繁殖受到抑制，甚至死亡。（8）通过对接种于冷却猪肉上的金黄色葡萄球菌的抑制试验研究表明，各抑菌剂均具有很好地抑制金黄色葡萄球菌的活性，其中1％石榴果皮提取物处理组和Fe2++0．5％石榴果皮提取物处理组的效果优于Nisin处理组。通过对冷却猪肉贮藏中的pH值、TVB-N值、细菌总数及感官评价等指标的综合分析表明，处理组中1％石榴果皮提取物对冷却猪肉的保鲜效果最好。本研究的创新点：（1）从食品安全保藏学的角度，采用生物活性示踪法，对石榴果皮的抑菌活性进行了较为系统地研究，表明石榴果皮中抑菌活性物质主要为石榴多酚。（2）首次对石榴果皮提取物抑菌机理进行了较为系统地研究。（3）首次将石榴果皮提取物应用到冷却猪肉的保鲜中，并取得了较好的效果。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 石榴资源的研究开发现状
• 1.1.1 石榴的生物学特性
• 1.1.2 我国石榴分布、生产概况
• 1.1.3 石榴的营养价值
• 1.1.4 石榴的生理活性
• 1.1.5 石榴的化学成分
• 1.2 植物源防腐剂的研究进展
• 1.2.1 植物源防腐剂的来源
• 1.2.2 植物抑菌活性成分
• 1.2.3 植物源活性成分的提取分离与结构鉴定
• 1.2.4 植物源天然防腐剂的抑菌机理
• 1.3 选题依据与研究内容
• 1.3.1 选题的依据及意义
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 石榴果皮抑菌活性的初步研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 试材
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 石榴果皮的溶剂提取
• 2.2.2 石榴果皮提取物抑菌活性测定
• 2.2.3 石榴果皮提取物最低抑菌浓度（MIC）测定
• 2.2.4 石榴果皮提取物最低杀菌浓度（MBC）测定
• 2.2.5 石榴果皮提取物化学成分分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 石榴果皮提取物抑菌活性测定
• 2.3.2 石榴果皮甲醇提物 MIC、MBC测定
• 2.3.3 不同品种不同部位石榴果皮提取物的抑菌活性
• 2.3.4 石榴果皮甲醇提取物化学成分系统预试
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 石榴果皮中抑菌活性物质提取工艺研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 试材
• 3.1.2 仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 石榴果皮提取液的制备
• 3.2.2 抑菌试验
• 3.2.3 单因素试验
• 3.2.4 石榴果皮抑菌活性物质的提取工艺参数优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 乙醇浓度对石榴果皮提取液抑菌活性的影响
• 3.3.2 液固比对石榴果皮提取液抑菌活性的影响
• 3.3.3 提取温度对石榴果皮提取液抑菌活性的影响
• 3.3.4 提取时间石榴果皮提取液抑菌活性的影响
• 3.3.5 石榴果皮抑菌活性物质提取工艺参数的优化
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 石榴果皮提取物抑菌特性研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 试材
• 4.1.2 试剂与药品
• 4.1.3 仪器设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 石榴果皮提取物抑菌谱测定
• 4.2.2 石榴果皮提取物 MIC、MBC测定
• 4.2.3 介质pH对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.2.4 石榴果皮提取物的热稳定性试验
• 4.2.5 紫外线对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.2.6 光照时间对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.2.7 盐、糖对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.2.8 金属离子对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 石榴果皮提取物抑菌谱测定结果
• 4.3.2 石榴果皮乙醇提取物 MIC、MBC测定结果
• 4.3.3 石榴果皮提取物与三种常见抑菌剂的活性比较
• 4.3.4 介质pH对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3.5 热处理对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3.6 紫外线照射对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3.7 光照时间对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3.8 盐、糖对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.3.9 金属离子对石榴果皮提取物抑菌活性的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 石榴果皮抑菌活性物质的分离及成分分析
• 5.1 材料
• 5.1.1 试材
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 仪器设备
• 5.2 方法
• 5.2.1 有机溶剂萃取分级
• 5.2.2 抑菌试验
• 5.2.3 化学成分系统预试
• 5.2.4 多酚的测定
• 5.2.5 单宁的测定
• 5.2.6 黄酮的测定
• 5.2.7 正丁醇萃取物柱层析分离
• 5.2.8 薄层层析鉴定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 有机溶剂萃取
• 5.3.2 各萃取部分抑菌活性的比较
• 5.3.3 化学成分系统预试
• 5.3.4 萃取前后多酚、单宁和黄酮含量变化
• 5.3.5 柱层析分离及其抑菌活性测定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 石榴果皮提取物的抑菌机理研究
• 6.1 材料
• 6.1.1 试材
• 6.1.2 试剂与药品
• 6.1.3 仪器设备
• 6.2 方法
• 6.2.1 呼吸代谢的抑制试验
• 6.2.2 石榴果皮提取物抑制金黄色葡萄球菌生长曲线的绘制
• 6.2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
• 6.2.4 扫描电镜和透射电镜观察
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 石榴果皮提取物对金黄色葡萄球菌呼吸的影响
• 6.3.2 石榴果皮提取物对金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
• 6.3.3 石榴果皮提取物对金黄色葡萄球菌表达蛋白的影响
• 6.3.4 石榴果皮提取物对金黄色葡萄球菌外观结构的影响
• 6.3.5 石榴果皮提取物对金黄色葡萄球菌超微结构的影响
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 石榴果皮提取物对冷却猪肉的保鲜作用研究
• 7.1 材料
• 7.1.1 试材
• 7.1.2 试剂与药品
• 7.1.3 仪器设备
• 7.2 方法
• 7.2.1 菌悬液制备
• 7.2.2 石榴果皮提取物对接种于冷却猪肉上金黄葡萄球菌的抑制试验
• 7.2.3 石榴果皮提取物对冷却猪肉保鲜试验
• 7.2.4 金黄色葡萄球菌总数的测定
• 7.2.5 菌落总数的测定
• 7.2.6 pH值测定
• 7.2.7 挥发性盐基氮（TVB-N）测定
• 7.2.8 感官评价方法
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 石榴果皮提取物对接种于冷却猪肉上的金黄葡萄球菌的抑制作用
• 7.3.2 pH值的变化
• 7.3.3 TVB-N值的变化
• 7.3.4 菌落总数变化
• 7.3.5 冷却猪肉在冷藏期间感官质量的变化
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 第八章 结论与创新点
• 8.1 结论
• 8.2 创新点
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介