论文摘要
背景与目的：原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，恶性程度高、手术切除率低。因此，化疗在肝癌的综合治疗中占重要的地位。但肝癌全身化疗的效果较差，肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）是导致肝癌化疗失败的主要原因之一。MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构及作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。MDR的发生机制比较复杂，包括增加药物外排、减少药物吸收、抗肿瘤药物靶位改变、药物活化作用减弱、DNA损伤修复能力增强及抗凋亡相关通路的改变等多个方面。线粒体一个非常重要的细胞器：为机体活动提供能量、调控氧化还原、调节钙离子浓度、介导细胞内信号传递等，尤其是调节细胞凋亡和坏死，线粒体担负着关键性作用。而细胞凋亡即是化疗药杀伤肿瘤细胞的共同通路。线粒体已成为筛选新型抗肿瘤药物的靶点之一。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，主要由3个亚单位构成，即端粒酶RNA（telomeraseRNA, TR）、端粒酶相关蛋白质（telomerase-associated protein, TP1/TP2）和端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase, TERT）。研究表明, hTERT表达水平随着端粒酶活性增加而相应成比例增加。hTERT是人类端粒酶活性的主要调控亚单位。端粒酶在正常人体组织表达呈阴性或阳性率很低，而在生殖细胞、胚胎干细胞和癌细胞中高表达，其主要功能是维持端粒的长度。端粒酶活性高表达参与了肿瘤发生、发展的过程。端粒酶也可能通过拮抗细胞凋亡等作用参与肿瘤细胞MDR发生。过度表达TERT可能传递化疗药物抵抗信号。端粒酶主要存在于细胞核。研究发现，端粒酶除了维持端粒长度的功能外，还具有非依赖端粒的功能，如氧化应激和药物治疗可导致端粒酶从细胞核转位到线粒体并保护线粒体功能（保护线粒体DNA、降低线粒体ROS等）并抵抗凋亡，而不能保护细胞核内的端粒，端粒继续缩短。由此推断，当肿瘤细胞接触化疗药物时，端粒酶可能从细胞核内移位到线粒体发挥线粒体保护作用，抵抗凋亡。因此，端粒酶线粒体转位可能是肿瘤细胞发生MDR的另一机制。本研究通过建立不同耐药程度的人肝癌耐药细胞系SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3细胞，探讨端粒酶线粒体转位在肿瘤多药耐药过程中可能作用，期望为多药耐药逆转提供新的干预手段。研究方法：本研究分两部分：第一部分：体外培养人肝癌细胞株SK-Hep1，采用大剂量冲击，间歇诱导法，用顺铂诱导SK-Hep1细胞耐药后，用极限稀释法克隆筛选，建立不同耐药程度的人肝癌耐药细胞系SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3细胞。倒置显微镜比较耐药细胞和亲本细胞形态，细胞计数法比较耐药细胞和亲本细胞的生长曲线；CCK-8法检测亲本细胞株和耐药细胞株对不同浓度的抗肿瘤药物的药物敏感性，计算半数抑制率（IC50）和耐药指数（RI）；流式细胞仪检测SK-Hep1和SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2、SK-Hep1/CDDP3的细胞周期。第二部分：免疫荧光染色及Western blot作hTERT在线粒体和细胞核的共定位分析。适时荧光定量PCR检测线粒体DNA氧化损伤及细胞端粒长度。采用荧光探针JC-1检测线粒体膜电位的变化。流式细胞仪检测SK-Hep1和SK-Hep1/CDDP1、 SK-Hep1/CDDP2、SK-Hep1/CDDP3的细胞凋亡率。研究结果：1.耐药细胞SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3细胞形态基本接近亲本细胞。2.与亲本细胞相比，耐药细胞SK-Hep1/CDDP1、 SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3生长缓慢,差异具有统计学意义（P<0.05）。3. CCK-8法测定SK-Hep1细胞IC50为5.42±0.04μg/mL，耐药细胞SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3细胞IC50分别为40.72±0.06μg/mL、50.48±1.02μg/mL、70.61±1.06μg/mL，耐药指数分别为7.51、9.31、13.03，耐药细胞对氟尿嘧啶（5-FU）、阿霉素（DOX）等抗肿瘤药物显示交叉耐药（P<0.01）。4.细胞周期检测显示，耐药细胞G2/M和S期所占比例较亲本细胞增加，G1期所占比例减少，两组相比差异均有统计学意义（P<0.01）。5.免疫荧光染色及Western blot检测显示：随着耐药指数增加，hTERT逐渐从细胞核转位到线粒体（P<0.05）。6.适时荧光定量PCR显示：随着耐药指数增加，耐药细胞端粒长度缩短；线粒体DNA损伤降低（P<0.01）。7.耐药细胞的线粒体膜电位下降（P<0.05）。8.细胞凋亡率检测显示，耐药细胞SK-Hep1/CDDP1、 SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3的凋亡率较亲本细胞下降（P<0.01）。结论：1.成功地建立不同耐药程度的人肝癌多药耐药细胞SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3。2.当肿瘤细胞接触化疗药物后，端粒酶可能从细胞核内移位到线粒体。3.耐药细胞线粒体端粒酶高度表达，可保护线粒体功能，抵抗凋亡。因此，端粒酶线粒体转位可能是肿瘤细胞MDR发生的另一机制。
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