论文摘要
经典的抗原递呈理论认为,抗原递呈细胞（antigen presenting cell, APC）在加工处理和递呈外源性抗原及内源性抗原时存在两种不同的途径,即分别为MHCⅡ类分子限制性途径和MHCⅠ类分子限制性途径。然而研究发现,外源性抗原经APC摄取、加工处理后,可与MHCⅠ类分子结合形成复合物,呈递到APC表面,进而活化CD8+T细胞,这种现象被称为交叉递呈。大量研究表明,颗粒性抗原、可溶性抗原等多种抗原都可以经过交叉递呈途径有效活化CTL应答。交叉递呈在机体抵抗感染非APC的病毒和其它病原微生物、诱导抗肿瘤免疫及维持外周耐受等方面都发挥着重要作用。树突状细胞（dendritic cells, DC）是体内最有效的专职APC,也是执行交叉递呈功能的主要细胞。DC需要经历由不成熟向成熟阶段的转变才能有效刺激T细胞活化。DC成熟过程中抗原摄取能力下降,同时伴随细胞表型及细胞形态的改变。所有这些变化均与受Rho GTPases家族调控的肌动蛋白细胞骨架重排关系密切。Rho家族由至少23个成员组成,其中以RhoA,Rac1和Cdc42研究最为广泛。近年来研究发现,Rho家族蛋白在DC的形态、内吞作用、迁移以及MHCⅡ类分子限制性递呈和交叉递呈中发挥着重要的调节作用。DC成熟过程中内吞能力的下降与Cdc42活化水平的下调密切相关;活化型Cdc42和RhoA可增强DC的MHCⅡ类分子限制性递呈;抑制Rac1可以减少DC对凋亡细胞的吞噬及交叉递呈。Rho家族成员虽然功能各不相同,但却具有高度的同源性,各成员间最主要的差别在于其高变的C-末端多碱基区,且研究认为C-末端多碱基区在Rho GTPases生理功能的发挥中起着关键性作用。Rac1通过其C-末端多碱基区不仅可以结合并活化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PAK,而且还可活化中性粒细胞NADPH氧化酶。此外,Rac2的C-末端多碱基区也是Rac2在细胞内的定位及细胞增殖、迁移等多种功能的发挥所必需的。以往研究利用Tat穿膜肽能够快速、高效的将Rho家族成员C-末端多碱基区带入细胞,并与下游信号通路中某些特定效应蛋白直接结合的特性,研究C-末端多碱基区在Rho家族蛋白介导的细胞功能中的作用。基于此,我们希望利用Tat穿膜肽与Rho家族不同成员C-末端多碱基区构成的融合肽,通过观察其对DC交叉递呈的影响来研究Rho家族不同成员C-末端多碱基区在DC交叉递呈中的作用。首先,本研究设计合成了6条由Tat穿膜肽和Rho家族不同成员C-末端多碱基区构成的融合肽,包括Tat-Rac1、Tat-hRac2、Tat-mRac2、Tat-Rac3、Tat-RhoA和Tat-Cdc42 C-末端融合肽,以及Tat对照肽,进而以表达dsRed-OVA144-386融合蛋白的大肠杆菌（E.coli BL21/pYOVA）为抗原,在成功建立DC2.4细胞抗原交叉递呈分析平台的基础上,分析了不同融合肽对树突状细胞系DC2.4交叉递呈的影响。本研究首次发现Tat-Rac1 C-末端肽能够显著增强DC2.4细胞的交叉递呈。其次,为了进一步证实Tat-Rac1 C-末端肽促进DC交叉递呈结果的可靠性,本研究首先成功诱导培养出小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）,并从细胞的形态、得率、纯度以及LPS刺激前后细胞表面分子的表达情况等几方面对所得细胞进行鉴定。结果表明,培养第7天的细胞具有典型的DC形态特征,纯度可达80%90%左右,且主要为不成熟DC。随后以E.coli BL21/pYOVA为抗原,在建立BMDC抗原交叉递呈分析平台的基础上,分析了Tat-Rac1 C-末端肽对BMDC交叉递呈的影响。结果证实,Tat-Rac1 C-末端肽明显促进BMDC的交叉递呈,与DC2.4细胞的结果一致。最后,本研究利用荧光显微镜和流式细胞术从DC的吞噬及成熟两方面对Tat-Rac1 C-末端肽促进DC交叉递呈的机制进行了初步探讨。首先以E.coli BL21/pYOVA为抗原观察Tat-Rac1 C-末端肽负载DC吞噬能力的改变。结果发现,Tat-Rac1 C-末端肽显著增强DC对细菌抗原的吞噬,提示Tat-Rac1 C-末端肽对DC抗原交叉递呈的促进作用部分是由于增强DC的抗原摄取能力所致。进而,本研究进一步分析了Tat-Rac1 C-末端肽增强DC抗原摄取能力的可能机制。以FITC标记的转铁蛋白、OVA、IgG抗体调理的大肠杆菌及葡聚糖四种荧光标记物为抗原,观察Tat-Rac1 C-末端肽负载DC抗原摄取能力的改变。结果表明,Tat-Rac1 C-末端肽并不影响DC对上述四种抗原的摄取,提示Tat-Rac1 C-末端肽增强DC的抗原摄取能力并不依赖于转铁蛋白受体介导的内吞、甘露糖受体介导的内吞、Fc段受体介导的吞噬以及巨吞饮这四条途径。随后,以表达OVA1-386蛋白的大肠杆菌为抗原,通过检测Tat-Rac1 C-末端肽负载DC表面分子的表达水平分析其对DC成熟的影响。结果发现,Tat-Rac1 C-末端肽不影响DC的成熟,提示该融合肽并不是通过促进DC的成熟而增强DC交叉递呈。综上所述,本研究通过观察Tat穿膜肽和Rho家族不同成员C-末端多碱基区构成的融合肽对树突状细胞系DC2.4交叉递呈的影响,首次发现Tat-Rac1 C-末端肽能够显著增强DC的交叉递呈,并在小鼠骨髓来源树突状细胞中得到证实。进一步分析Tat-Rac1 C-末端肽促进DC交叉递呈的机制,发现Tat-Rac1 C-末端肽明显增强DC对细菌抗原的吞噬,说明Tat-Rac1 C-末端肽对DC抗原交叉递呈的促进作用部分是由于增强DC的抗原摄取能力所致,而与DC的成熟无关。DC抗原摄取能力的促进作用可能是通过补体受体介导的吞噬或网格蛋白非依赖的内吞途径来实现的,而并不依赖于转铁蛋白受体介导的内吞、甘露糖受体介导的内吞、Fc段受体介导的吞噬以及巨吞饮这四条途径。本研究为进一步理解DC交叉递呈的分子机制提供新的理论依据,同时,将Tat-Rac1 C-末端肽用于DC疫苗的抗肿瘤治疗将对肿瘤免疫治疗的研究产生重要影响。
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