黑芥子酶协助蛋白基因启动子功能的缺失分析

论文摘要

十字花科植物中存在一个特殊的底物—酶系统，即硫苷—黑芥子酶系统（Glucosinolate-Myrosinase system）。在植物体内，黑芥子酶往往与黑芥子酶结合蛋白和黑芥子酶协助蛋白一起以复合体的形式存在。iMyAP是一种存在于营养器官中的诱导表达的蛋白。创伤、MeJA，JA和ABA处理能使iMyAP启动子启动iMyAP基因转录。为了进一步了解iMyAP基因启动子的功能结构特征，确定iMyAP基因启动子的核心启动子（core promoter）大小，我们将油菜（Brassica napus）iMyAP基因转录起始位点上游-1868bp区段的全部和部分（分为5个不同长度）插到GUS报告基因的前面，并将融合子转入模式植物拟南芥（Arabidopsis thalina）基因组中。在拟南芥的遗传背景下来剖析iMyAP基因启动子的功能结构。研究结果显示，甲基茉莉酸和创伤处理能使iMyAP启动子启动GUS基因在植株体内表达。地上部分与地下部分相比较，地上部分染色较深，而地下部分染色较浅；微管组织染色较深，薄壁组织染色较浅；茎叶与根的接合区染色最深。通过缺失分析发现只需要iMyAP启动子全长序列中从-1到-370区段的370bp的长度就可以实现全长启动子的诱导功能。带有的370bp长片段的M4-5植株受创伤和茉莉酸处理后，都能启动GUS基因的表达，并且GUS基因在组织中的表达部位和强度基本一致；进一步缺失到只有153bp长时，创伤和茉莉酸处理不能诱导GUS基因的表达，说明这段DNA序列不具备在诱导条件下启动基因表达的功能。通过在PLACE网站上对这段370bp的序列进行基序分析，发现在占总长约为19％的这370bp长的序列上，包含有iMyAP全部8类诱导基序，并拥有全长iMyAP启动子唯一的1个与茉莉酸诱导相关的基序；唯一的1个与生长素诱导有关的基序；与创伤诱导有关的基序两个中的1个，唯一的1个与生长素诱导有关的基序；唯一的1个与糖诱导有关的基序；与创伤诱导有关的基序两个中的1个；与无氧诱导有关的基序ANAERO1CONSENSUS四个中的3个；与干旱脱水诱导有关的6种基序，其中MYCATERD1和MYCATRD22是全长启动子中唯一的基序。这些数据与GUS组织化学染色的结果一起充分说明了370bp长启动子片断代表了诱导型iMyAP启动子的基本特征，是iMyAP启动子的核心结构，即iMyAP启动子的核心启动子。这是首次确定iMyAP启动子的核心启动子大小。370bp长的核心启动子不仅能受甲基茉莉酸和创伤诱导启动基因的表达，而且还具有细胞组织特异型启动子的特征。该核心启动子在正常生长条件下，能启动GUS基因在气孔器保卫细胞中特异表达，成为了一个典型的细胞组织特异型启动子。但是，我们目前已知的器官组织细胞特异性表达的基序通常都不在370bp的范围之内。这种表面看似矛盾的现象暗示：是否可能存在一种未知的保卫细胞特异表达的基序，这有待我们进一步的实验来证实。这种因为缺失一定长度后获得的“启动子”在保持原有启动子功能的同时，又能产生出新的启动功能，这种现象尚未见有报道。对M4-1到M4-6进行的GUS定量分析结果显示：在—1868～—1506bp之间的363bp长的核苷酸序列上存在增强子，因为这段序列的缺失导致GUS活性有一个较大幅度的下降。这是首次在iMyAP启动子上发现有增强子的存在。核心启动子能在高温胁迫和正常条件下都能启动GUS基因在气孔保卫细胞里表达。但是从被染色气孔保卫细胞的数量来讲，高温下气孔染色的数量明显低于正常条件下气孔染色的数量，说明高温有抑制370bp片段启动GUS基因在保卫细胞中表达的作用。核心启动子能在低温胁迫和正常条件下都能启动GUS基因在气孔保卫细胞里表达。但是气孔保卫细胞的染色数量也明显低于正常条件下气孔染色的数量。通过PLACE对启动子全长序列分析，在370bp的序列上没有找到目前已知的与低温反应有关的基序，所以通过核心启动子的进一步实验解剖分析，将会找到新的与低温反应有关的基序。受低温处理的M4-1植株其根部只在维管束部分和第三层柱细胞（third story columella cell，S3）中部的2个细胞有深的GUS染色，而维管束外围的薄壁组织和根尖伸长区不染色。蓝色在根尖弯曲的相反方向一侧，伸长区与成熟区的交界部位，其中柱部分大约一半有蓝色，另一半没有蓝色；就柱细胞而言，S3的中间两个有蓝色，其中与弯曲方向相反的一个柱细胞染色明显比另一个强，这两个观测事实似乎暗示iMyAP可能参与根向重力性（gravitropism）的某个过程。这个推测有待进一步的实验证实。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 硫代葡萄糖苷—黑芥子酶系统
• 1.1 硫苷
• 1.1.1 硫苷的结构
• 1.1.2 硫苷的生物合成
• 1.1.3 硫苷降解
• 1.2 黑芥子酶及其复合体
• 1.2.1 黑芥子酶的性质和特点
• 1.2.2 黑芥子酶与黑芥子酶复合体
• 1.2.3 黑芥子酶细胞
• 1.3 硫苷—黑芥子酶系统在植物防御反应中的作用
• 2 植物启动子
• 2.1 启动子组成
• 2.1.1 TATA框
• 2.1.2 一般上游启动子元件
• 2.1.3 特殊的上游元件
• 2.2 植物基因启动子分类
• 2.2.1 组成型启动子
• 2.2.2 细胞、组织或器官特异型启动子
• 2.2.3 在生殖器官中的特异表达的启动子
• 2.2.4 诱导型启动子
• 3 本研究的主要内容和意义
• 第二章 iMyAP启动子的分段扩增与表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 药品与试剂
• 1.3 方法
• 1.3.1 iMyAP启动子序列分析
• 1.3.2 双元表达载体构建
• 1.3.2.1 PCR反应用引物
• 1.3.2.2 PCR反应、产物回收和测序
• 1.3.2.3 双元表达载体的构建
• 1.3.3 工程菌转化
• 1.3.3.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 1.3.3.2 热激法转化大肠杆菌
• 1.3.3.3 冻熔法转化根癌农杆菌
• 2 结果与分析
• 2.1 iMyAP启动子基序分析
• 2.2 目的序列克隆与PCR扩增检测结果
• 2.3 测序结果的同源性比对
• 2.4 表达载体转化农杆菌后的检测
• 3 讨论
• 3.1 感受态细胞的制备和转化
• 3.2 PCR扩增
• 3.3 目的序列克隆的筛选与鉴定
• 3.4 双元表达载体的构建
• 第三章 拟南芥的遗传转化及转化子的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 药品及试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 方法
• 1.4.1 拟南芥的培养（栽培）
• 1.4.2 拟南芥的遗传转化
• 1.4.2.1 农杆菌的扩大培养
• 1.4.2.2 浸花法转化拟南芥
• 1.4.3 转化子的筛选
• 2 结果
• 2.1 不同的农杆菌菌株转化的结果
• 2.2 转化子的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 有关拟南芥的遗传转化
• 3.2 转化子的筛选
• 第四章 iMyAP启动子启动功能的分段分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 药品试剂与仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 转化子的生长与处理
• 1.3.1.1 茉莉酸处理
• 1.3.1.2 创伤处理
• 1.3.1.3 高低温处理
• 1.3.2 GUS活性的组织化学检测
• 1.3.3 大规模叶片GUS荧光定量检测
• 1.3.3.1 样品制备
• 1.3.3.2 蛋白质定量分析
• 1.3.3.3 GUS活性检测
• 1.3.4.数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 GUS活性的组织化学检测
• 2.1.1 甲基茉莉酸诱导GUS基因表达的结果
• 2.1.2 创伤诱导GUS基因表达的结果
• 2.1.3 诱导型启动子转变为保卫细胞组织特异性启动子
• 2.1.4 温度变化与不同长度iMyAP启动子的诱导作用
• 2.1.5 iMyAP启动子诱导启动组织细胞水平上的GUS基因表达
• 2.2 叶片GUS荧光定量检测
• 2.2.1 叶片BSA蛋白质标准曲线
• 2.2.2 4—甲基伞形酮标准曲线
• 2.2.3 叶片GUS活性荧光定量检测结果
• 3 讨论
• 3.1 蛋白质含量的测定方法
• 3.2 诱导型iMyAP启动子的特征和核心启动子
• 3.3 根尖中GUS表达的特征分析
• 参考文献
• 符号表
• 致谢
• 作者简历