论文题目: 斯氏假单胞菌固氮调节基因nifLA的表达调控机制研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 遗传学
作者: 解志红
导师: 林敏,王国英
关键词: 斯氏假单胞菌,基因,酵母双杂交系统,表达调控
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501分离自非豆科作物水稻根际,在无铵和微好氧的条件下能将空气中氮气固定为植物可以吸收利用的铵,是一种潜在的微生物肥料,具有重要的理论研究和实际应用价值。本研究采用基因敲除、酵母双杂交系统及蛋白体外结合技术,对斯氏假单胞菌A1501固氮调节基因nifLA进行了功能鉴定和表达调控机制的研究。 构建了斯氏假单胞菌A1501的粘粒基因组文库,筛选到两个阳性克隆,分别为XL1,XL2。然后以pUC19为载体,从中筛选到7.7Kb包含nifLA-like的阳性克隆,并完成了核苷酸序列分析（EMBL/GenBank登陆号为:AJ297529）。遗传学分析表明该菌nifL-like及nifA-like与棕色固氮菌（A.vinelandii）在核苷酸序列上的同源性分别为78%、85%,在氨基酸序列上的同源性分别为72%、82%,暂分别命名为nifA及nifL。利用Southern杂交证实nifL在P.stutzeri A1501中为单拷贝。 将nifHp-lacZ融合基因表达载体转入A1501野生性菌株中,在不同的铵和氧浓度诱导后测定其β—半乳糖苷酶活性,结果表明斯氏假单胞菌A1501的固氮基因表达受铵和氧的调控。为了研究nifLA的固氮调节功能,构建了nifL及nifA突变株及其互补质粒。结果显示nifA突变株及nifL极性突变株的固氮酶活性丧失;nifL非极性突变株仍有部分固氮活性,且对铵和氧不敏感,在高铵下,仍有一定的固氮活性。nifA的组成性表达质粒pVA3仅恢复nifA突变株的三分之一的固氮活性,增强了A1501及nifL非极性突变株的固氮活性。而nifL的组成性表达质粒pVL抑制了A1501及nifL非极性突变株中固氮酶的表达。过量表达的NifA增强了nifHp-lacZ的表达,而过量表达的NifL对nifHp-lacZ的表达没有大的影响,表明在A1501中存在固氮正调节蛋白NifA和负调节因子NifL。 采用酵母双杂交系统研究NifL和NifA蛋白在表达调控中的相互作用。构建了nifL和nifA全长序列及其不同结构域区段的酵母双杂交质粒。酵母双杂交实验证明NifA的中间结构域与NifL的羧基端之间在酵母体内存在直接的相互作用。构建了pET28a-nifL及pGEX2T-nifA融合表达载体。利用体外沉降方法证实NifL与NifA在细胞外也可以结合,表明斯氏假单胞菌A1501中可能存在一个通过NifL与NifA相互作用关闭nif基因表达的调控机制。 构建了A1501 nifLAp-lacZ融合表达载体,分别将其转入A1501野生型及ropN-和ntrC-突变菌株中。β半乳糖苷酶活性的测定结果表明,nifLA基因的启动子为σ54-依赖型,nifLA正常水平的表达需要σ54因子及NtrC的参与。 在上述研究的基础上,初步提出了P.stutzeri固氮基因转录调控模式,即固氮负调节因子NifL感受外界氮和氧的信号,与固氮正调节因子NifA互作,控制nif基因系统的表达。这将为今后采用基因工程手段打破联合固氮的氧和铵限制,获得稳定高效的联合固氮效率奠定重要的理论基础。
论文目录:
摘要
Abstract
缩略词
第一章 固氮基因表达调节机理的研究进展
1 前言
2 Klebsiella pneumoniae (K.p)固氮调节的分子机制
2.1 固氮基因簇(nifcluster)的结构与功能
2.2 固氮酶结构基因(nifHDK)操纵子的表达
2.3 NifA正调节蛋白与NifL负调节蛋白之间的相互作用
3 Azotobacter vinelandii (A.v)固氮调节的分子机制
3.1 固氮基因簇的结构与功能
3.2 固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节
3.3 调节基因(nifLA)的表达调节
3.4 NifA和NifL相互作用
4 Azospirillum brasilense (A.b)固氮调节的分子机制
4.1 固氮基因簇的定位、结构与功能
4.2 固氮酶结构基因(nifHDK)的表达调节
4.3 正调节基因组成型表达
4.4 NifA的激活——P_Ⅱ蛋白的作用
4.5 固氮酶活性的调节—DraT-DraG调节系统
5 不同种属固氮菌的NifL-NifA固氮调控机理的比较
5.1 NifL结构域
5.2 配基结合对NifL-NifA互作的影响
5.3 固氮酶的表达调控
5.4 NifL感应氧的调控机制
5.5 NifL与NifA动态定位
5.6 NifL抑制固氮酶的机制
5.7 固氮菌中NifL-NifA复合物调控小结
6 本论文的立题依据
第二章 固氮调节基因nifLA的克隆及序列分析
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 培养基与抗生素
1.3 酶、试剂及试剂盒
1.4 β-半乳糖苷酶活性分析试剂
1.5 克隆nifL及nifA所用的引物
2 方法
2.1 A1501菌株基因组DNA的分离
2.2 A1501基因组DNA的部分酶切
2.3 质粒载体的制备
2.4 基因组DNA部分酶切片段与去磷酸化质粒pLA2917的连接
2.5 噬菌体蛋白包装连接产物
2.6 包装体转染大肠杆菌
2.7 PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.8 PCR产物的纯化
2.9 酶切及连接反应(Sambrook et al., 1989)
2.10 琼脂糖凝胶中DNA片段的回收
2.11 Southern杂交
2.12 高效率转化感受态细胞的制备、转化
2.13 菌株固氮活性测定
2.14 乙烯的标定
2.15 β-半乳糖苷酶活性分析
2.16 总蛋白的测定
3 结果与分析
3.1 铵和氧对斯氏假单胞菌A1501固氮酶活性的影响
3.2 铵和氧对固氮结构基因nifH表达的影响
3.3 斯氏假单胞菌A1501粘粒文库的构建
3.4 菌落PCR筛选阳性菌株
3.5 Southern杂交验证阳性菌株
3.6 nifLA-like的亚克隆
3.7 固氮菌nifL及nifA的聚类分析
3.8 固氮调节基因nifLA的序列分析
3.9 nifL基因拷贝数的鉴定
4 讨论
4.1 DNA文库构建
4.2 基因拷贝数的鉴定
4.3 斯氏假单胞菌A1501中不存在大质粒
第三章 固氮调节基因nifL和nifA的功能研究
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 酶、试剂和试剂盒
1.3 引物
2 方法
2.1 细菌总RNA的提取
2.2 第一链cDNA的合成
2.3 其它的实验方法
3 结果与分析
3.1 固氮调节基因nifL极性与非极性突变株的构建
3.2 nifA突变株和nifL突变株的固氮表型
3.3 RT-PCR验证nifL突变株中NifA的表达
3.4 nifA组成性表达质粒pVA3的构建
3.5 重组质粒pVA3对A1501野生型及突变株固氮酶活性的影响
3.6 nifL组成性表达质粒pVL的构建
3.7 重组质粒pVL对A1501突变株及野生型固氮酶活性的影响
3.8 过量表达的NifA及NifL蛋白对固氮酶转录活性的影响
3.9 不同转录因子对固氮酶表达活性的影响
4 讨论
4.1 P. stutzeri A1501中是否存在DraT-DraG调节系统
4.2 利用RT-PCR鉴定基因的转录
第四章 利用酵母双杂交系统研究NifA与NifL的互作
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 酵母培养基
1.3 酵母转化用溶液及缓冲液
1.4 其它的实验方法
1.5 引物
2 酵母双杂交系统的原理
3 方法
3.1 酵母感受态细胞的制备及转化
3.2 酵母质粒DNA的提取
3.3 β-半乳糖甘酶活性滤纸分析
3.4 β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)活性的测定
4 结果与分析
4.1 NifA，NifL及其不同结构域重组质粒的构建
4.2 NifL蛋白与NifA蛋白之间相互作用的研究
4.3 NifL蛋白与NifA蛋白之间作用区域的定位
4.4 NifL蛋白与NifA蛋白结构域
5 讨论
5.1 酵母双杂交系统已成为研究蛋白互作的重要手段
5.2 斯氏假单胞菌中存在一个NifL-NifA调控系统
第五章 NifL与NifA的体外互作
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液及缓冲液
1.3 酶，试剂及主要仪器
1.4 蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
1.5 纯化His-Tag融合蛋白的NTA缓冲液的配制
1.6 GST重组蛋白质亲和纯化(GSH-Sepharose)缓冲液的配制
1.7 引物
2 方法
2.1 融合蛋白的诱导表达及SDS-PAGE分析
2.2 可溶性分析
2.3 发酵时间的优化
2.4 NifA-His融合蛋白的纯化
2.5 GST-NifLc融合蛋白的纯化
2.6 在谷胱甘肽层析柱中的细胞外蛋白结合实验
2.7 在NTA层析柱中细胞外蛋白结合实验
2.8 以T7·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序
2.9 以GST·Tag Antibody AP Conjugate为抗体的蛋白杂交程序
3 结果与分析
3.1 pET28a-NifA融合表达载体pETA的构建
3.2 pGEX2T-NifLc融合表达载体pGLc的构建
3.3 融合蛋白的诱导表达及发酵时间的优化
3.4 融合蛋白的可溶性分析
3.5 SDS-PAGE确定目标蛋白在洗脱液中的分布情况及大量纯化
3.6 分别以T7·Tag抗体和GST·Tag抗体检测NifL与NifA在细胞外的结合
4 讨论
第六章 固氮斯氏假单胞菌nifLA基因表达的调控机制研究
1 材料
1.1 菌株和质粒
1.2 酶、试剂和试剂盒
1.3 引物
2 方法
3 结果与分析
3.1 nifLAp-lacZ融合表达载体的构建过程
3.2 固氮斯氏假单胞菌nifLA基因启动区的克隆
3.3 nifLA基因启动子片段克隆到pLA2917载体上
3.4 lacZ-Km盒克隆到nifLA启动子后的编码区
3.5 nifLAp-lacZ融合基因在野生型菌株及突变菌株中的表达
3.6 ONPG法定量测定结合子的β-半乳糖苷酶活性
4 讨论
4.1 NifA是固氮菌的转录激活蛋白
4.2 nifLA调控不同固氮菌的异同
4.3 斯氏假单胞菌固氮基因的转录调控模式
第七章 结论
1 本论文的工作中得到的确定结果
2 本项研究的创新点
参考文献
致谢
附录1.A1501固氮调节基因nifLA的核苷酸序列及推断的开放读码框
附录2.斯氏假单胞菌nifLA基因启动子区
附录3.重组质粒pET28a-nifL的构建流程
附录4.pGAD-nifA，pGAD-nifL，pGAD-nifAm质粒构建图
附录5.重组质粒pGBD-nifA，pGBD-nifL和pGBD-nifLc的构建
个人简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
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- [2].固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运基因的功能鉴定及表达调控研究[D]. 李红权.中国农业科学院2005
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