产木质素降解酶真菌的分离及其发酵条件的研究

论文摘要

木质素是由苯丙烷结构单元分子之间通过稳定的化学键形成的复杂芳香族高分子化合物,由于其立体结构的复杂性,所以很难被水解。自然界中能降解木质素的微生物主要有细菌、放线菌和真菌。其中真菌起着主要作用。真菌参与木质素的降解作用酶主要是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶和漆酶,它们都是菌体分泌的胞外氧化酶。这些氧化酶对多种污染物都表现出了广谱的降解作用,包括酚类、多环芳烃、各种染料、五氯联苯等难降解物质,随着人类对环境污染和资源危机等问题的认识不断深入,从自然环境中分离可降解污染物的微生物并对它们所产污染物降解酶进行研究,是当代环境保护与经济发展的重大课题,也是对当代科学技术提出的新要求。本研究从自然界中分离纯化一些真菌菌株,研究了这些菌株产木质素降解酶的能力,并对产木质素降解酶能力较强的菌株进行分类鉴定。通过液体发酵培养,期望获得木质素降解酶酶活力高的发酵条件。主要结果如下：1、木质素降解真菌的筛选。采用子实体组织分离法获得了14株纯菌株。以固体平板上的显色反应为初筛,进行快速筛选木质素降解酶的产生菌,综合愈创木酚氧化和苯胺蓝脱色结果,菌株Ga2、S2和W1在平板上显色明显,初步断定这些菌株有较强的产木质素降解酶能力。复筛过程在液体培养条件下进行,对经初步筛选有木质素降解酶产生能力的菌株进行液体发酵,测定其木质素降解酶活力。2、产木质素降解酶菌株W1的分子鉴定及其系统发育树的构建。提取其总DNA,选用真菌通用引物ITS序列进行,进行PCR手段克隆扩增菌株W1的5.8sRNA及其两侧的转录间隔区（rDNA-ITS）,经与GenBank中已有的菌株序列比对,发现与多株Irpex lacteus序列有较高的相似度,为确定它们间的进化关系,将W1与8株I. lacteus菌序列比对,随后借助软件MEGA4.0的邻接法构建了系统发育树,由发育树可知,W1与I. lacteus XSD-2亲缘关系最近。3、I. lacteus W1菌株的锰过氧化物酶（MnP）和木质素过氧化物酶（LiP）液体发酵条件的优化。（1）分别采用单因素试验、正交设计和响应曲面法,优化I. lacteus W1菌株产MnP培养条件。单因素试验结果显示I. lacteus W1产MnP的最佳碳氮源为葡萄糖、酵母粉,培养条件为28℃、pH5.5、120rpm/min。正交设计指示影响MnP产量的3个主要因素分别为诱导剂’Tween 80、酵母粉和葡萄糖。最优培养基组合为葡萄糖15g／L,酵母粉0.2g／L,KH2PO4 3. Og/L, MgSO4·7H2O0.7g/L, Tween 80 lg/L。经正交设计优化试验MnP产量提高至67.7U／L,增加67%。Plackeet-Burman设计得出影响MnP产量的3个主效应因素为Tween 80、酵母粉和葡萄糖。经Box-Beheken design设计优化了3个主效应因素,预测了最佳产MnP的条件为葡萄糖、酵母粉和Tween 80分别为17.67g／L、0.18g／L和1.40g／L。在优化后的培养基上MnP产量为53.8U／L,是原培养条件下的1.26倍。（2）通过单因素试验优化LiP产量。研究了不同浓度的葡萄糖和酒石酸铵浓度、诱导剂Tween 80及温度、转速、培养液初始pH对LiP产量的影响,结果显示,最佳培养条件为葡萄糖20g／L、酒石酸铵0.1g／L、添加0.5g/LTween80初始pH为5.0的30℃静置培养。在优化后的培养条件下LiP产量为33.7U／L,是初始值的1.31倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 概述
• 1.1 木质素是一类难降解的复杂高分子有机物质
• 1.1.1 木质素的结构
• 1.1.2 木质素的主要降解菌
• 1.1.3 木质素的降解机制
• 1.1.4 木质素降解条件
• 1.2 木质素的主要降解酶
• 1.2.1 锰过氧化物酶
• 1.2.2 木质素过氧化物酶
• 1.2.3 漆酶
• 1.3 木质素降解菌的研究进展
• 1.3.1 生物制浆、纸浆漂白
• 1.3.2 印染废水
• 1.3.3 废弃物再利用
• 1.3.4 预处理原料,降低工业能耗
• 1.3.5 降解有毒物
• 1.3.6 与重金属的相互作用
• 1.3.7 非灭菌条件
• 1.3.8 共培养技术
• 1.3.9 固定化技术和反应器连续培养
• 第二章 木质素降解菌的分离与筛选
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 菌种的分离
• 2.2.4 菌种初筛
• 2.2.5 菌种复筛
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌株的分离
• 2.3.2 菌种初筛
• 2.3.3 菌种复筛
• 2.4 结论
• 第三章 菌株W1的签定和系统树的构建
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株
• 3.2.2 培养基和试剂
• 3.2.3 菌体的培养与收集
• 3.2.4 基因组DNA的提取
• 3.2.5 rDNA-ITS区域的PCR扩增
• 3.2.6 系统发育树的构建
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 rDNA-ITS的序列扩增
• 3.3.2 ITS序列同源性分析
• 3.4 结论
• 第四章 木质素降解酶发酵条件的优化
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种和培养基
• 4.2.2 试验方法
• 4.2.3 实验设计
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 MnP培养基的优化
• 4.3.2 LiP产酶培养条件的优化
• 第五章 结论和展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的论文