p300通过激活RASSF2基因表达诱导胃癌细胞HGC-27细胞周期S/G2阻滞的分子机制

论文摘要

抑癌基因RASSF2由于启动子处DNA超甲基化而导致的基因沉默与胃癌的发生和发展密切相关。有研究发现,组蛋白乙酰转移酶p300能够激活胃癌细胞SGC-7901细胞中RASSF2基因的表达并诱导细胞晚期凋亡,从而抑制细胞增殖。已知,RASSF2基因对细胞增殖的抑制机制包括细胞凋亡和细胞周期停滞两种途径。而p300激活RASSF2对胃癌细胞周期的影响及作用机制目前还未见报道。本论文中,我们通过集落形成实验发现p300能够抑制胃癌细胞HGC-27的增殖,而该抑制作用可以被RASSF2的干涉质粒部分逆转。Western Blot检测和RT-PCR结果证实,p300激活了HGC-27细胞中RASSF2基因的表达。这说明,在HGC-27细胞中,p300通过激活RASSF2抑制细胞增殖。流式细胞术结果显示,过表达p300或抑制RASSF2表达都能诱导HGC-27细胞中S期细胞数明显增加,而G2/M期细胞数明显下降。而共转染p300过表达质粒与RASSF2 siRNA质粒时,S期以及G2/M期的细胞数都恢复到了与对照组相近的水平。Western Blot结果表明,p300激活RASSF2基因表达能够促进HGC-27细胞中p21的表达,以及磷酸化pRb对未被磷酸化pRb蛋白表达的比例。同时p300激活RASSF2基因导致磷酸化p38蛋白表达水平的下降。以上结果说明,p300通过激活RASSF2影响了HGC-27细胞周期相关因子的表达水平,诱导S/G2细胞周期停滞。另外,染色质免疫沉淀（ChIP）实验结果表明,p300通过HAT活性提高了RASSF2启动子处Sp1结合位点以及CpG岛的组蛋白H3和H4的乙酰化水平。同时,MSP和BSP的结果表明,p300激活RASSF2基因转录与RASSF2基因启动子CpG岛的DNA去甲基化相关。这说明,组蛋白乙酰化修饰和DNA去甲基化都在p300激活RASSF2基因转录过程中发挥重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 研究背景
• 一、RASSF2 基因与肿瘤
• （一） RASSF 基因家族
• （二） 抑癌基因RASSF2
• （三） RASSF2 基因甲基化与肿瘤
• 二、组蛋白乙酰化修饰酶p300/CBP 与肿瘤
• （一） 组蛋白乙酰化修饰
• （二） p300/CBP 结构和功能
• 三、组蛋白乙酰化修饰与DNA 甲基化的关系
• 四、本论文的研究内容和意义
• （一） 立题依据
• （二） 本文的研究内容和意义
• 第二部分 实验材料与方法
• 一、实验材料
• （一） 质粒
• （二） 蛋白质和抗体
• （三） 哺乳动物细胞系
• （四） 试剂
• 二、实验方法
• Ⅰ. 分子生物学试验方法
• （一） 分子克隆技术
• （二） DNA 琼脂糖电泳
• （三） 质粒的大量制备
• （四） 哺乳动物细胞总DNA 的提取
• （五） 哺乳动物细胞总RNA 的提取
• （六） 逆转录（Reverse Transcription，RT）
• （七） PCR 和荧光定量realtime PCR
• （八） 染色质免疫沉淀（ChIP）
• （九） 甲基化特异性PCR（methylation specific PCR, MSP）
• （十） 亚硫酸氢钠测序法（bisulfite genomic sequencing, BSP）
• Ⅱ. 细胞生物学实验方法
• （一） 哺乳动物细胞系培养
• （二） 脂质体瞬时转染
• （三） 蛋白质的Western Blot 分析
• （四） 流式细胞术
• （五） 集落形成
• Ⅲ 统计学分析
• 第三部分 实验结果与分析
• 一、p300 通过上调RASSF2 基因表达抑制HGC-27 细胞增殖
• 二、p300 通过上调RASSF2 表达诱导细胞周期S/G2 停滞
• 三、p300 激活RASSF2 基因活性对细胞周期调控因子表达水平的影响
• 四、p300 激活HGC-27 细胞RASSF2 基因转录
• 五、p300 提高RASSF2 启动子处组蛋白H3 和H4 的乙酰化水平
• 六、p300 抑制RASSF2 启动子CpG 岛的DNA 甲基化水平
• 第四部分 讨论
• 一、p300 通过激活RASSF2 诱导细胞周期S/G2 停滞的分子机制
• 二、p300 诱导细胞周期阻滞与Ras 信号通路的关系
• 三、p300 激活RASSF2 基因表达的表观遗传机制
• 主要结论和创新点
• 一 主要结论
• 二 主要创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 在学期间公开发表论文及著作情况