地塞米松促进β-淀粉样蛋白引起大鼠学习记忆能力下降及机理研究

论文摘要

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种中枢神经系统退行性疾病,其特征性神经病理变化是老年斑、神经纤维缠结和神经元丢失等,并以海马受累最严重。其病因尚不完全清楚,缺乏有效的治疗措施。因此,积极研究AD的发病机制是临床和基础医学面临的重要课题。β-淀粉样蛋白（Amyloidβ-peptide protein, Aβ）是AD形成和发展的关键因素,Aβ由39～42个氨基酸残基组成,在其多肽序列中,Aβ25-35片断的神经毒性较强。目前研究已证实:Aβ25-35能通过氧化应急增加细胞内Ca2+浓度、影响细胞内信号传导、抑制神经轴突的快速转运机制导致神经元损伤。海马是学习记忆中非常重要的区域,富含大量的糖皮质激素受体（glucocoricoids receptor, GR）,是糖皮质激素（glucocorticoids, GCs）作用的主要靶位。研究发现,当人或动物处于强烈的急性应激或长期慢性应激状态时,其学习记忆能力可受到明显的影响。GCs是机体的一类正常激素,具有多种生理和药理作用,近几年的研究结果显示,体内高水平的GCs可以引起海马突触丢失,海马萎缩,加重海马齿状回神经元凋亡。目前,国内外都注重研究Aβ、GCs分别与AD发病之间的关系,但将Aβ与GCs相关联,研究它们之间的相互促进海马神经元细胞毒作用却很少。为此,本研究拟（1）在体内,研究地塞米松（Dexamethasone, DEX）促进Aβ引起大鼠学习记忆能力下降和海马神经元损伤及其可能作用机制;（2）在体外培养大鼠海马神经元的基础上,进一步观察DEX促进Aβ引起海马神经元损伤,研究其可能的作用机制。为探讨AD发病机理提供理论依据。目的在体内外实验条件下,观察DEX、Aβ及其联合作用对海马神经元的影响,以探讨GCs是否加重Aβ的神经元毒性作用以及机理研究。方法利用大鼠海马CA1区注射Aβ25-35的方法建立大鼠早老性痴呆模型,运用Morris水迷宫和病理组织检查,研究DEX（1 mg/kg/d,5 mg/kg/d）和Aβ（5μg）以及联合作用对大鼠学习记忆能力和海马组织病理的影响。运用免疫组化的方法,检测DEX、Aβ以及DEX+Aβ对p-tau表达的影响。取孕18天Sprague Dawley（SD）大鼠胚胎的海马神经元进行体外原代分离培养,于联合实验中先加入10μM DEX作用24h后,再加入5μM Aβ25-35作用24h观察损伤情况。应用MTT法进行细胞活力分析;用western blot分析测定核NF-κB（Nuclear Factor kappa B）、p53和p-tau蛋白含量,用RT-PCR分析测定p53mRNA的水平,进一步探讨DEX是否通过下调核NF-κB蛋白水平,上调p53和p-tau蛋白水平促进Aβ的神经元毒性。结果1.大鼠海马CA1区注射Aβ25-35可诱导大鼠早老性痴呆模型,损伤大鼠的学习记忆能力。大鼠双侧海马CA1区注射5μg Aβ25-35或sc , DEX（ 5 mg/kg/d,连续7 d）,可使大鼠逃避潜伏期和游泳距离稍延长,但无统计学意义;1 mg/kg/d DEX,sc,连续7 d对大鼠逃避潜伏期和游泳距离无明显影响;DEX和Aβ25-35联合使用后d9,大鼠逃避潜伏期及游泳距离明显延长,并有部分动物死亡。病理检验结果显示, 5 mg/kg/d DEX+ 5μg Aβ25-35组CA1区神经元数目明显减少,排列紊乱,脱失现象明显,核固缩为三角形或多角形,浓染。2.免疫组化结果显示:溶剂对照组大鼠海马CA1区仅检测到少量tau阳性细胞。DEX（1 mg/kg）组p-tau阳性细胞数量稍增多（p>0.05）。DEX（5 mg/kg /d）、Aβ组大鼠海马神经元中p-tau阳性细胞数量明显增加,与溶剂对照组相比差异有显著性（p<0.05）。与Aβ组比较, DEX（1 mg/kg或5 mg/kg /d ）+Aβ组p-tau阳性细胞数量明显增多（p<0.05）。3.细胞活力检测发现（MTT法）,不同浓度DEX（0.01, 0.1, 1, 10μM）对海马神经元活性没有影响（p>0.05）, Aβ25-35剂量依赖性地降低海马神经元细胞活力（p<0.05）。DEX（1μM或10μM）预处理海马神经元24 h,可进一步降低Aβ25-35（1μM或5μM）引起的细胞活力下降（p<0.05）4.在原代培养的海马神经元中加入5μM Aβ25-35后,分别于1 h,2 h,4 h,8 h提取胞浆蛋白和核蛋白,通过western blot分析结果显示:Aβ25-35能时间依赖性的引起核NF-κB p65蛋白水平增加,作用4 h后达到高峰,8 h后略有下降,但仍高于正常。与对照组相比,Aβ25-35组的核NF-κB表达量明显增加（P<0.05）,DEX组、DEX+Aβ25-35组变化不明显（p>0.05）。与Aβ组相比,DEX组可下调Aβ25-35引起的上升的海马神经元核NF-κB p65蛋白水平（p<0.05）;此外我们进一步研究了DEX与Aβ25-35联合作用对海马神经元胞质IκBα蛋白表达的影响。结果显示,与对照组相比,10μM DEX作用海马神经元时,胞浆IκBα表达量增加（p<0.05）,Aβ25-35组表达量降低（P<0.05）,DEX+Aβ25-35组变化不明显（p>0.05）。与Aβ组相比,DEX可上调细胞质的IκBα蛋白水平（p<0.05）。5.与对照组相比,10μM DEX作用海马神经元时,p53蛋白水平差异无统计学意义（p>0.05）;5μM Aβ组差异有显著性（p<0.05）,但与同剂量的Aβ组相比,DEX+Aβ组的p53蛋白表达量变化不明显（p>0.05）。6.与对照组（0μM Aβ）相比,0.5, 1, 5μM的Aβ作用海马神经元1 h,p-tau表达量明显增加,10μM Aβ作用组,p-tau表达量达到峰值。此外,10μM DEX、5μM Aβ作用海马神经元,其p-tau表达量也明显增加（p<0.05）,DEX+Aβ组的p-tau表达量与同剂量的DEX和Aβ相比,差异有显著性（p<0.05）。7. RT-PCR结果显示: Aβ、DEX+Aβ促进p53 mRNA的水平增加（p<0.05）。DEX+Aβ组的p53 mRNA水平与同剂量的Aβ相比,差异无统计学意义（p>0.05）。结论在体内,DEX可加重Aβ引起大鼠学习记忆能力下降,导致大鼠海马CA1区神经元数目明显减少、排列紊乱、脱失现象明显、核固缩为三角形或多角形、浓染,此外,免疫组化结果显示thr231位点磷酸化tau阳性细胞表达明显增加。以上结果提示:海马神经元损伤,学习记忆能力下降可能与神经细胞减少,tau蛋白异常磷酸化增多有关;在体外,DEX下调了Aβ25-35引起的上升的海马神经元核NF-κB蛋白水平,上调了细胞质中的IκBα蛋白水平,上调了Aβ25-35引起的上升的thr231位点磷酸化tau水平。从而提示DEX可能通过促进神经元胞内p-tau蛋白水平的升高、上调IκB蛋白水平或/和抑制核NF-κB蛋白水平来加重神经元毒性作用。此外,DEX+Aβ组的p53蛋白表达和p53 mRNA水平与同剂量的Aβ相比,差异无统计学意义,提示GCs促进Aβ引起海马神经元可能不通过p53途径。因脑内的Aβ随年龄不断增加,糖皮质激素增强Aβ的神经元毒作用可能是GCs诱导老年鼠记忆损伤的机制之一,也可能与AD病因学有关。

论文目录

• 英文缩略词表
• 地塞米松促进β-淀粉样蛋白引起大鼠学习记忆能力下降及机理研究
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1. 前言
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6. 参考文献
• 7. 附录（个人简历）
• 8. 致谢
• 9. 综述
• 及参考文献