延髓Apelin/APJ系统参与应激性高血压大鼠发病并介导针刺降压

论文摘要

高血压病是危害人类健康的常见病、多发病,不仅发病率高,而且容易并发冠心病、心力衰竭、中风、肾功能衰竭等严重并发症。应激是高血压病的重要危险因素,随着现代社会生活节奏加快,社会、心理应激加剧,应激性高血压在高血压发病中所占的比例日益增大,这使得对应激性高血压发病机制的研究变得尤为重要。APJ受体是一种G蛋白偶联受体,与血管紧张素Ⅱ1型受体（AT1）存在高度的同源性,Apelin为其内源性配体。Apelin/APJ系统与心血管活动的调节密切相关。已有文献报导,Apelin基因的多态性与人原发性高血压的发病有关,而在SHR, rVLM中功能增强的Apelin/APJ系统促进了自发性高血压的发病,那么该通路是否也参与了应激性高血压的发病呢?针刺是我国传统医学的重要治疗方法,针刺降压因其疗效确切、副作用少而得到广泛应用。有文献报导针刺可通过调节rVLM中某些信号通路发挥降压作用,那么参与高血压发病的Apelin/APJ系统是否也是针刺降压的作用靶点呢?本课题的假设为：应激可导致大鼠rVLM中Apelin/APJ系统活性增强,从而导致高血压的发病,而针刺可通过调节该活性增强的信号系统发挥降压作用。本研究采用随机分组法,将体重250-280g的健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组（Control）、应激性高血压组（SIHR）、电针组（SIHR+EA）和假电针组（SIHR+SEA）。Control组动物给予正常饲养,SIHR组动物用足底电击结合噪声的方式连续应激14天,SIHR+EA组和SIHR+SEA组动物在应激的第10～14天选取经应激后血压较应激前上升20mmHg以上的个体同时附加电针或假电针治疗（电针采用足三里穴,假电针采用非穴位组织）。本研究中所采用的实验技术主要有脑灌注固定、冰冻切片、免疫组织化学、中枢微量注射及中性红染色等。造模过程中用尾压仪监测各组动物的血压发现,从应激第3天起SIHR组、SIHR+EA组、SIHR+SEA组动物与Control组动物相比血压开始升高并出现显著统计学差异（p值均<0.01）；但在电针治疗开始后,SIHR+EA组血压开始较SIHR组、SIHR+SEA组下降,并于电针第3天开始出现显著统计学差异（p值均<0.01）；电针第5天,即应激的最后一天,SIHR+EA组血压与Control组相比,虽然存在升高趋势,但无显著统计学差异（p=0.92）；SIHR+SEA组血压与SIHR组相比则无显著统计学差异（各时间点p值均>0.05）。造模完成后,各组股动脉收缩压统计结果显示,SIHR组动物股动脉收缩压（160.58±3.32mmHg）较Control组（116.00±2.00mmHg）显著升高（p<0.01）,而SIHR+EA组（119.69±284mmHg）较SIHR组显著下降（p<0.01）,但SIHR+SEA组（159.92±301mmHg）与SIHR组无显著统计学差异（p=0.99）,SIHR+EA组与Control组无显著统计学差异（p=0.92）。这说明该应激性高血压造模方法可靠,电针的降压效应确定,而假电针无降压作用,各组动物模型制作成功,可用于后续实验。利用免疫组织化学方法检测各组大鼠rVLM中Apelin、APJ受体表达的结果表明：Apelin在SIHR组大鼠rVLM中的表达（神经元计数和相对光密度值）较Control组大鼠显著增加（p值均<0.01）；Apelin在SIHR+EA组大鼠rVLM中的表达较SIHR组大鼠显著下降（p值均<0.01）,与Control组大鼠相比,虽然偏高,但无显著统计学差异（p=0.82,p=0.89）;Apelin在SIHR+SEA组大鼠rVLM中的表达与SIHR组大鼠无显著统计学差异（p=0.84,p=0.79）；APJ受体在各组大鼠rVLM中的表达（神经元计数和相对光密度值）相似,无显著统计学差异（p=0.92,p=0.96）。这提示在SIHR的rVLM中,Apelin/APJ系统活性很可能是增强的；而在SIHR+EA组大鼠,电针很可能是通过抑制rVLM中Apelin/APJ系统活性来发挥降压作用的。利用中枢微量注射技术,研究中观察了Apelin在各组大鼠rVLM中的升压效应,以及间接了解了各组大鼠rVLM中APJ受体总体活性的改变。结果显示,同浓度同剂量Apelin在SIHR组大鼠rVLM引起的升压幅度显著高于Control组;在SIHR+EA组大鼠rVLM引起的升压幅度显著低于SIHR组,但与Control组无显著统计学差异；在SIHR+SEA组大鼠rVLM引起的升压幅度与SIHR组无显著统计学差异。这提示在SIHR组大鼠rVLM中APJ受体总体活性是增强的；在SIHR+EA组大鼠,电针治疗可降低已增强了的APJ受体活性；但在SIHR+SEA组大鼠,假电针没有这一作用。综合免疫组织化学结果及Apelin在rVLM的升压作用背景,提示在SIHR rVLM中Apelin/APJ系统活性是增强的,且该系统活性增强促进了应激性高血压模型的发病。而在SIHR rVLM微量注射APJ受体拮抗剂（Apelin-13,pGlul,Alal3）观察到,单独注射APJ受体拮抗剂无明显降压效应,但在rVLM微量注射APJ受体拮抗剂2分钟后,再注射Apelin,可显著减弱外源性Apelin在SIHR rVLM的升压效应。综合以上结果,本课题的结论为：rVLM中Apelin/APJ系统活性增强促进了SIHR的发病,但该机制可能不是发病机制中最为关键的部分；电针可能通过抑制rVLM中增强了的Apelin/APJ系统活性发挥一定的降压作用,但该机制可能不是针刺降压的主要机制。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 实验动物
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要试剂
• 1.4 常用试剂配制及处理
• 2. 方法
• 2.1 实验动物分组及模型制备
• 2.2 大鼠清醒状态下的血压和心率测定
• 2.3 一般手术操作及股动脉压的测定
• 2.4 免疫组织化学方法检测rVLM Apelin及APJ受体的表达
• 2.5 中枢核团rVLM区的微量注射
• 3. 实验数据统计学处理
• 结果
• 1. 造模过程中各组大鼠的血压变化及造模完成后各组血压比较
• 1.1 造模过程中各组大鼠的血压变化
• 1.2 造模完成后各组大鼠股动脉收缩压比较
• 2. Apelin、APJ受体在各组大鼠rVLM中的表达比较
• 2.1 Apelin在各组大鼠rVLM中的表达比较
• 2.2 APJ受体在各组大鼠rVLM中的表达比较
• 3. Apelin在各组大鼠rVLM中的升压效应比较
• 3.1 rVLM微量注射位点的鉴定
• 3.2 不同浓度Apelin升压效应比较
• 3.3 同浓度Apelin在各组大鼠rVLM中的升压效应比较
• 4. APJ受体拮抗剂在SIHR rVLM的效应
• 讨论
• 1. 应激性高血压模型、电针降压模型评价
• 1.1 应激性高血压模型评价
• 1.2 电针降压模型评价
• 2. Apelin在rVLM的升压效应
• 3. APJ受体拮抗剂在SIHR rVLM的效应
• 3.1 APJ受体拮抗剂在SIHR rVLM无降压效应
• 3.2 APJ受体拮抗剂的作用浓度
• 4. rVLM中与血压调节及高血压发病有关的信号通路
• 4.1 一氧化氮（NO）系统
• 4.2 活性氧（ROS）系统
• 4.3 乙酰胆碱（ACh）信号通路
• 5. rVLM中高血压相关信号通路与Apelin/APJ系统的关系
• 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录：硕士在读期间发表的论文
• 文献综述
• 参考文献