紫外光（UV-B）对金丝桃细胞中黄酮类次生产物合成的影响及其信号转导机理研究

论文摘要

高等植物是植物药等天然活性物质的重要来源。虽然植物是一种可再生资源，但是由于受到栽培困难、生长速度慢、无计划采伐以及近年来对天然活性物质要求不断增加等因素的影响使某些植物天然产物的供需矛盾日益突出。利用细胞全能性原理发展起来的植物细胞培养技术为植物天然活性物质的生产提供了一条全新途径。但目前制约该项技术产业化应用的核心问题之一是普遍存在的培养细胞中活性物质的低产现象，因此提高培养细胞代谢产物含量已经成为决定细胞培养技术能否实现产业化的关键因素。中波紫外辐射（UV-B，280～320nm）对植物的影响是近年来的研究热点，低浓度的紫外线能诱导植物的多种反应，其中类黄酮物质的快速积累是许多植物对UV-B处理的常见早期反应之一。因此，利用UV-B处理植物细胞可以诱发黄酮次生物质的合成积累，并成为提高植物培养细胞次生物质产量的有效手段之一。然而，目前对UV-B诱发植物细胞黄酮类次生物质合成积累的详细机制尚不十分了解。本文以本实验室构建保存的金丝桃细胞为材料，测定了UV-B对金丝桃中黄酮类物质合成的影响，在确定UV-B对金丝桃细胞中类黄酮合成积累具有促进作用的基础上，进一步研究探讨了UV-B诱发金丝桃细胞中黄酮类物质合成的信号转导机理，主要实验结果如下：1、金丝桃悬浮细胞系的建立和优化。将固体培养的金丝桃愈伤组织接种到MS培养液中，为获得最优细胞生物量和黄酮含量，对培养液成分（植物激素组成、pH值和蔗糖浓度）、培养温度、摇床转速和接种量等条件进行优化，得到了金丝桃悬浮细胞系的最适培养条件：培养液为MS+1．5×10-5mol·L-1NAA+10-6mol·L-1BA+3％蔗糖，使用前pH值调至5．8，培养温度为25℃，摇床转速为100rpm，接种量为3g／50mL medium。并且在此培养条件下测得细胞生长周期为2周。在优化培养条件的过程中，对传代种细胞进行筛选，最终获得了生长速度较快、形态比较稳定的金丝桃悬浮细胞系。2、紫外光（UV-B）对金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累的影响。将培养了5d的生长旺盛的金丝桃细胞用UV-B处理后测定金丝桃细胞的生长量和黄酮类物质的含量，结果显示处理后5h到30h内，虽然金丝桃细胞的生长量没有显著变化，但黄酮的产量大幅提高，表明UV-B处理可以诱发金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累。3、NO参与UV-B对金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累。数据表明UV-B处理后金丝桃细胞中一氧化氮（NO）的含量大幅增加；通过加入NO的专一性淬灭剂cPTIO和一氧化氮合酶抑制剂PBITU，发现它们不仅能抑制UV-B诱导的NO的产生还能抑制UV-B触发的黄酮类物质的积累，表明UV-B处理可以激活金丝桃细胞中NO信号事件，而且还依赖NO信号分子诱发金丝桃中黄酮类物质的合成积累。4、H2O2是UV-B诱发金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累必需的信号分子。实验结果显示UV-B处理后金丝桃细胞中过氧化氢（H2O2）的含量大幅增加；通过加入过氧化氢酶CAT和质膜NAD（P）H氧化酶抑制剂DPI，发现这两者不仅能抑制UV-B诱导的H2O2的产生还能抑制UV-B触发的黄酮类物质的积累，表明UV-B处理还可以激活金丝桃细胞中H2O2信号事件，而且H2O2信号分子也是参与UV-B诱发金丝桃中黄酮类物质合成积累所必需的信号分子之一。5、H2O2对NO诱发金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累中的增效作用。以外源H2O2和NO分别处理金丝桃细胞，并测定细胞中黄酮类物质的含量，结果表明NO单独处理能够增加黄酮类物质的合成而H2O2对其产量没有影响：但同时加入H2O2和NO时比只用NO处理的金丝桃细胞中黄酮产量高，说明H2O2本身对黄酮合成没有影响，但能够加强NO对金丝桃细胞中黄酮类物质合成的积累，表明H2O2对NO诱发金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累中有增效作用。6、H2O2和NO的信号互作。实验结果表明，H2O2处理可以提高细胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性并诱发细胞中NO合成，说明H2O2可以催化细胞中NO合成积累；而NO处理也可以提高细胞中H2O2水平，说明NO对细胞中H2O2的合成积累也具有促进作用。试验结果表明H2O2和NO信号分子之间存在着一种特殊的互催化信号放大作用，揭示了金丝桃细胞中NO和H2O2之间一种新的信号互作用现象。7、H2O2对NO诱发的金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累的增效作用依赖于两种信号分子之间的互催化反应。DPI和PBITU不仅能够抑制H2O2和NO之间的互催化反应，而且还能抑制H2O2对NO诱发黄酮类物质合成积累的增效作用，表明H2O2对NO诱发黄酮类物质合成积累的增效作用可能依赖于两种信号分子之间的互催化反应。8、NO和H2O2通过不同的机制介导UV-B诱发的金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累。UV-B可以诱导细胞中黄酮类次生物质生物合成途径的第一个关键酶CHS基因的表达上调，NO淬灭剂cPTIO可以抑制UV-B诱发的CHS表达，但H2O2淬灭剂CAT对UV-B诱发的CHS表达无影响，说明NO介导UV-B诱发黄酮类物质合成积累与CHS基因的表达活化有关，而H2O2介导的UV-B诱发黄酮类物质合成积累与CHS基因的表达活化无关。因此，本文实验结果表明NO和H2O2通过不同的机制介导UV-B诱发的金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 1.1 紫外光（UV-B）的研究现状
• 1.2 植物次生代谢产物的研究现状
• 1.2.1 植物次生代谢及其产物
• 1.2.2 黄酮类物质的结构和分类
• 1.2.3 黄酮类物质的生理活性功能
• 1.2.4 黄酮类物质的应用
• 1.2.5 贯叶金丝桃的化学成分及其生理作用
• 1.3 提高植物细胞培养中次生代谢产物产量的方法
• 1.3.1 外植体的选择
• 1.3.2 高产细胞系的选择
• 1.3.3 培养基和培养条件的优化
• 1.3.4 诱导子
• 1.3.5 生物技术手段
• 1.4 本论文的研究思路和主要研究内容
• 第2章 金丝桃细胞悬浮培养的条件优化
• 2.1 材料、试剂和实验仪器
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器及设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 悬浮细胞生长量、细胞干重的测定
• 2.2.2 总黄酮含量的测定
• 2.2.3 金丝桃悬浮细胞系培养条件的优化
• 2.2.4 高产细胞系的筛选与细胞生长周期的确定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 金丝桃悬浮细胞系培养条件的优化
• 2.3.2 金丝桃悬浮细胞系的建立
• 2.4 讨论
• 第3章 紫外光（UV-B）诱导的黄酮类物质的积累
• 3.1 材料、试剂和实验仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器及设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 紫外光（UV-B）处理
• 3.2.2 悬浮细胞的培养及生长量的测定
• 3.2.3 黄酮含量的测定
• 3.3 结果分析
• 第4章 参与紫外光（UV-B）诱导金丝桃细胞中黄酮类物质合成积累的信号分子研究
• 4.1 材料、试剂和实验仪器
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要仪器及设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 悬浮细胞的培养及生长量的测定
• 4.2.2 黄酮含量的测定
• 4.2.3 NO含量的测定
• 2O₂含量的测定'>4.2.4 H₂O₂含量的测定
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 UV-B诱导的基于NO的黄酮类次生代谢物质的积累
• 2O₂的黄酮类次生代谢物质的积累'>4.3.2 UV-B诱导的基于H₂O₂的黄酮类次生代谢物质的积累
• 4.4 结果分析
• 2O₂在UV-B诱导的黄酮类物质产生中的相互作用'>第5章 NO和H₂O₂在UV-B诱导的黄酮类物质产生中的相互作用
• 5.1 材料、试剂和实验仪器
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 主要试剂
• 5.1.3 主要仪器及设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 悬浮细胞的培养及生长量的测定
• 5.2.2 黄酮含量的测定
• 5.2.3 No含量的测定
• 2O₂含量的测定'>5.2.4 H₂O₂含量的测定
• 5.2.5 NOS活性的测定
• 5.2.6 RNA的分离和分析
• 5.3 实验结果
• 2O₂在诱导黄酮类物质产生中的相互作用'>5.3.1 NO和H₂O₂在诱导黄酮类物质产生中的相互作用
• 2O₂信号之间的相互催化作用'>5.3.2 NO和H₂O₂信号之间的相互催化作用
• 2O₂在黄酮生产上的增效作用依赖于它们的相互催化反应'>5.3.3 NO和H₂O₂在黄酮生产上的增效作用依赖于它们的相互催化反应
• 2O₂通过不同的作用机制介导UV-B诱导的黄酮类物质的积累.'>5.3.4 NO和H₂O₂通过不同的作用机制介导UV-B诱导的黄酮类物质的积累.
• 5.4 结果分析
• 第6章 结论
• 参考文献:
• 附录A 部分试剂和培养基配制
• 附录B MS母液的配制
• 附录C 缩略词汇表
• 致谢