苏云金芽胞杆菌胶原酶基因colB1的克隆表达及其在Bt感染昆虫中的功能研究

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bt）是世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,在多种害虫的综合防治中发挥了重要作用。作为一种重要的昆虫病原菌,Bt可以产生许多毒力因子帮助其侵入宿主,从而抵抗不利环境并生长繁殖,这些毒力因子包括许多降解酶类和毒素,如磷脂酶C、溶血素、蛋白酶、胶原酶等。本文主要研究了苏云金芽胞杆菌来源的胶原酶ColB1在Bt感染昆虫中的功能作用。1.colB1基因的克隆、表达及活性鉴定从YBT-1520菌株中克隆得到colB1基因,其核苷酸长度2898 bp,编码965个氨基酸,预测分子量110 kDa。将colB1基因克隆到pET28a载体,并在大肠杆菌中超量表达。纯化的ColB1蛋白能在明胶平板上产生水解圈,以Ⅰ型胶原为底物,采用茚三酮显色法测得该蛋白的酶活力为27.2 U/mL,比活力为2709 U/mg。2.ColB1蛋白与Cry1Ac复配能增强Cry1Ac对棉铃虫的杀虫活性以棉铃虫幼虫为供试昆虫,采用混合饲料法和表面涂布法测定了ColB1蛋白对杀虫晶体蛋白Cry1Ac的增效作用。混合饲料法生测结果表明,高浓度的ColB1蛋白能增强Cry1Ac的杀虫活性。表面涂布法测定结果显示,混合ColB1蛋白浓度组的死亡率均大于等于单独Cry1Ac浓度组,且其增效作用更明显。3.BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究序列比对发现,colB1基因与已公布的苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171基因组中BMB171C0475的氨基酸序列一致性高达99%。首先通过RT-PCR和GFP转录融合方法证明colB1基因在BMB171中能够转录和表达,之后利用同源重组敲除BMB171中colB1基因。用突变体芽胞和Cry1Ac定量混合喂食棉铃虫幼虫,生测结果显示突变体芽胞与晶体蛋白混合感染时对棉铃虫的毒性比对照菌株低,但差异并不明显。将cry1Ac基因分别转入突变体BMB1242和对照菌株BMB171,直接用发酵液进行生物测定,结果显示突变体BMB1242-1Ac引起棉铃虫的死亡率明显比对照菌株低。因此,缺失colB1基因能够降低Bt对棉铃虫的毒力。本研究第二部分克隆来自cry1Ac基因的BtⅠ-BtⅡ启动子、SD序列以及终止子,并引入pET28a的His-tag和多克隆位点,在穿梭载体pHT304的基础上构建了一个苏云金芽胞杆菌表达载体pBMB1A。将cry1Ac以及具有非典型BtⅠ-BtⅡ启动子的cry2Ab、cry5Ba、cry6Aa、cry7Ba、cry55Aa六个基因装载到该表达载体上,显微镜检结果表明cry1Ac、cry5Ba、cry7Ba、cry55Aa均能形成正常晶体,SDS-PAGE结果也证实这四个重组质粒均能表达目的条带。同时,本实验选取Cry1Ac来考察His-tag标签对Cry1Ac杀虫活性的影响,生物测定结果显示重组菌株的LC50值与对照菌株相比无明显差异。因此,该载体可用于快速克隆表达不同类别的Cry蛋白。同时,我们利用ctc2基因启动子构建了另一个表达载体pBMBC2,并成功表达crylAc基因且能形成晶体。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一章 苏云金芽胞杆菌胶原酶在Bt感染昆虫中的功能研究
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌及其杀虫活性
• 1.1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.1.2 苏云金芽胞杆菌的生物活性成分
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用模式
• 1.3 蜡状芽胞杆菌群的毒力因子
• 1.4 胶原和胶原酶
• 1.4.1 胶原的结构与类型
• 1.4.2 胶原酶概述
• 1.4.3 细菌胶原酶的应用
• 1.5 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株、质粒和引物
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.3.1 质粒抽提所用试剂
• 2.1.3.2 感受态制备所用试剂
• 2.1.3.3 SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂
• 2.1.3.4 供试昆虫及生物测定饲料
• 2.1.3.5 胶原酶活性测定所用试剂
• 2.1.3.6 酶和其它试剂
• 2.1.4 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 常规DNA操作
• 2.2.1.1 苏云金芽胞杆菌质粒的抽提
• 2.2.1.2 大肠杆菌质粒的抽提
• 2.2.1.3 苏云金芽胞杆菌总DNA的抽提
• 2.2.1.4 质粒DNA的脱盐
• 2.2.1.5 DNA的体外重组
• 2转化'>2.2.1.6 大肠杆菌的CaCl₂转化
• 2.2.1.7 苏云金芽胞杆菌的电转化
• 2.2.1.8 大肠杆菌转化子的筛选
• 2.2.1.9 苏云金芽胞杆菌重组菌的筛选
• 2.2.1.10 PCR扩增
• 2.2.1.11 凝胶试剂盒回收DNA片段
• 2.2.1.12 同源重组
• 2.2.2 RNA抽提及反转录PCR
• 2.2.2.1 TRIzol法抽提RNA
• 2.2.2.2 RT-PCR（Reverse transcript PCR）
• 2.2.3 苏云金芽胞杆菌colB1基因的超量表达与纯化
• 2.2.4 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯
• 2.2.5 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体显微镜观察
• 2.2.6 蛋白的SDS-PAGE电泳
• 2.2.6.1 配制SDS-PAGE凝胶
• 2.2.6.2 电泳、染色及脱色
• 2.2.6.3 SDS-PAGE电泳的蛋白样品制备
• 2.2.7 蛋白的定量
• 2.2.8 胶原酶的活性鉴定
• 2.2.8.1 明胶水解活性鉴定
• 2.2.8.2 胶原酶酶活测定
• 2.2.9 生物测定
• 2.2.9.1 棉铃虫混合饲料法
• 2.2.9.2 棉铃虫表面涂布法
• 3 结果与分析
• 3.1 苏云金芽胞杆菌胶原酶的序列分析
• 3.2 colB1基因在大肠杆菌中的表达和纯化
• 3.3 ColB1蛋白的活性鉴定
• 3.4 ColB1蛋白与Cry1Ac复配对棉铃虫的生物测定
• 3.4.1 杀虫晶体蛋白Cry1Ac的提纯和浓度测定
• 3.4.2 混合饲料法对棉铃虫的生物测定
• 3.4.3 表面涂布法对棉铃虫的生物测定
• 3.5 BMB171中ColB1在Bt感染昆虫中的功能研究
• 3.5.1 BMB171中colBl基因转录水平和表达水平检测
• 3.5.1.1 RT-PCR进行转录水平检测
• 3.5.1.2 荧光镜检进行表达水平检测
• 3.5.2 colB1插入缺失突变体的构建
• 3.5.2.1 插入缺失载体的构建
• 3.5.2.2 插入缺失突变体的筛选和验证
• 3.5.3 缺失突变体芽胞和Cry1Ac定量混合对棉铃虫的生物测定
• 3.5.4 缺失突变体发酵液对棉铃虫的生物测定
• 4 总结与讨论
• 第二章 苏云金芽胞杆菌表达载体的构建
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的分类及其多样性
• 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的表达调控
• 1.2.1 转录水平的调控
• 1.2.2 转录后水平的调控
• 1.2.3 翻译水平的调控
• 1.2.4 翻译后水平的调控
• 1.3 S-层蛋白的启动子
• 1.4 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 利用cry1Ac基因表达调控元件构建苏云金芽胞杆菌表达载体
• 3.1.1 载体pBMB1A的构建
• 3.1.2 重组菌株的构建
• 3.1.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测
• 3.1.4 重组菌株的生物测定
• 3.2 利用ctc2基因启动子构建苏云金芽胞杆菌表达载体
• 3.2.1 载体pBMBC2的构建
• 3.2.2 重组菌株的构建
• 3.2.3 重组菌株晶体形成和蛋白表达检测
• 4 总结与讨论
• 参考文献
• 致谢