论文摘要
易于采样、便于疾病检测的手段对维护奶牛产后健康和奶牛场经济效益至关重要。肝功酶检测不仅对奶牛产后肝脏机能正常与否可以提供直接参考依据,也可对体脂过度动员引起酮病等重要代谢疾病提供参考依据。乳房炎的真菌性病原在广西部分奶牛场不易治愈,诊断也非常困难。本研究：第一,探索奶牛泌乳早期部分肝功能酶在血浆与乳清中的活性及其相关性,评价能否用乳清代替血浆进行肝功酶检测。其目的在于寻找便于监控奶牛产后肝功能状况的途径。第二,对奶牛乳房炎微生物病原调查中对奶牛影响最大的一种真菌性病原一白色念珠菌,进行快速诊断试纸条检测方法研究,旨在建立乳房炎白色念珠菌快速诊断方法。第一部分丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）是重要的肝功能代谢酶,在动物的肝脏疾病检测中发挥重要的作用。本试验通过监测健康奶牛血液和牛奶中的ALT、AST、GGT及ALP活性,并探讨其相关性。方法：选取广西某规模化奶牛场35头荷斯坦奶牛,在分娩后3～9周之间采集的血液和牛奶样本,每周采样1次,及时分离血浆与乳清,采样常规分析方法分别测定其中的ALT、AST、GGT及ALP活性,对其结果进行统计学相关与回归分析。结果表明：四种酶在血浆和乳清中的活性呈极显著正相关,（ALT,r=0.852,P<0.001;AST,r=0.341,P<0.001;GGT,r=0.628,P<0.001;ALP,r=0.707,P<0.001）。血浆与乳清中ALT（P<0.05）活性十分接近,而血浆的AST（P<0.001）活性明显高于乳清的,而血浆的GGT、ALP活性显著（P<0.001）低于乳清的活性。进一步回归分析显示,以血浆为因变量,乳清为自变量,描述了一个一元的函数方程,即四种酶而伴随着血浆中酶的活性变化,乳清中的酶活性也随着变化（ALT,P<0.001;R2=0.72;AST,P<0.001;R2=0.11;GGT;R2=0.43,P<0.001; ALP;R2=0.52,P<0.001）,其回归模型分别为：ALT:y=1.78（x0.79）,R2=0.72,P<0.001。AST:y=57.48e0.009x,R2=0.11,P<0.001。GGT:y=2.22（x0.34）,R2=0.43,P<0.001。ALP:y=20.74（x0.26）,R2=0.52,P<0.001。结论：本研究中奶牛乳清的GGT、ALP活性均高于血浆,血浆的ALT活性与乳清中十分接近且呈极显著正相关。总的来看,除了AST之外,从乳清中检测这些酶有望成为监测奶牛肝功能的新途径,乳清中ALT检测可作为奶牛泌乳早期血浆ALT检测的替代普检手段。第二部分奶牛乳房炎是造成奶牛业经济损失最严重的疾病之一。本文调查研究了我国广西部分地区奶牛的白色念珠菌性乳房炎的发病率、致病力等情况；研究了不同种药物对白色念珠菌的药物敏感性效果。同时,对牛奶中白色念珠菌快速诊断方法进行研究,探索能够在临床实践中快速检测牛奶中的白色念珠菌的试纸条检测方法,以便及时采取防治措施。本研究对广西的6个规模化牛场疑似感染白色念珠菌病例收集奶样,根据白色念珠菌生长特性,采用传统的病原微生物学、革兰氏染色、无菌膜生长的鉴定、假菌丝鉴定检、墨染法鉴定、TTC—玉米吐温琼脂培养基（TCTA）显色鉴定、聚合酶链式反应（PCR）以及经生化管鉴定方法,对白色念珠菌进行分离鉴定,用统计方法分析感染白色念珠菌的奶牛乳房炎发生率。将随机选取临床鉴定的白色念珠菌菌株进行小鼠攻毒实验,进行致病力的检测。选6只昆云小白鼠注射生理盐水为对照组,实验组选取20只小鼠分3批攻毒白色念珠菌,经48小时观察小鼠生理变化情况。用多种单味药敏实验：西药：林可霉素、环丙沙星、硫酸卡那霉素、硫酸庆大霉素、硫酸小诺霉素、酮康唑、氟康唑。中药：五倍子、土槿皮、黄连、黄柏、知母、丁香、肉桂、大蒜和奶牛场16种常用药物（如澳龙乳炎康、硫酸卡那霉素、乳宫菌毒康等）进行药敏实验。白色念珠菌快速诊断试纸条的相关研究：（1）白色念珠菌抗体制备：采用白色念珠菌颗粒性抗原免疫新西兰大白兔制备白色念珠菌多克隆抗体；同时也免疫Balb/c小鼠,再采用细胞融合技术进行杂交瘤阳性克隆筛选,筛选出阳性杂交瘤细胞进行体外和体内培养制备白色念珠菌单克隆抗体。（2）胶体金颗粒的制备、金标抗的制备、金标抗体结合垫的制备和试纸条的组成。（3）试纸条在临床上的应用：用临床上鉴定的白色念珠菌菌株以及其他的菌株进行敏感性与特异性检测。本研究的结果如下：通过镜检、生化管和RCR等7种方法对临床顽固性的乳房炎的牛奶样进行病原微生物分离鉴定,在6个不同的牛场共检测116份奶样,共分离出509株菌,其中真菌153株（通过镜检）。而真菌中白色念珠菌分离鉴定为阳性的结果：（1）经革兰氏染色镜检,占总分离菌株的20%,占真菌的67%。（2）无菌膜生长的鉴定,占总菌株数的20.08%,占真菌的96.73%。（3）假菌丝鉴定检出率达100%。（4）TCTA检出率分别占总分离菌与真菌的20.43%和67.97%。（5）墨染法鉴定中分别占总菌株数与真菌数的23.97%和79.74%。 （6）菌液PCR中占总菌株数23.18%,占真菌的77.12%。（7）经生化管鉴定,产气葡萄糖的鉴定中有产酸产气和产酸菌株分别占总菌株数的17.29%、5.11%;分别占真菌数的57.51%、16.99%；在甘露糖化管中培养,有产酸产气和只产酸占总菌株数分别为18.27%、4.72%,分别占真菌数为60.78%、15.69%；在半乳糖、麦芽糖、果糖3种生化鉴定中,分别占总菌株数的23.18%、22.00%、22.59%,占真菌中的分离率依次为77.12%、73.20%、75.16%。白色念珠菌攻毒与药敏试验实的结果,本实验用白色念珠菌接种20只小白鼠,死亡11只,死亡率达55%,其致病率达100%,半数致死量（LD5o）达1.97×105 cfu/g,从所有小白鼠的肝脏、腹水、肺以及部分血液中分离到白色念珠菌,小白鼠在剖检后可见腹水增多及各器官充血肿大,器官表面有大小不一的脓肿小结节；通过组织切片镜检观察,发现大多数器官有炎症及细胞病变。药敏实验结果表明：当各种中药的浓度为10mg/mL时,大蒜的效果最好,其次黄连,其它药效较差。当各种中药的浓度为20mg/mL时,药效最好的是大蒜与黄连,其极敏率分别达100%、87.5%。当各种西药浓度为10mg/mL时,本实验选取的7种西药当中,酮康唑与氟康唑较敏感,其高敏率分别达37.5%、25%；选取牛场常用的16种药品中,Lineo（利内奥）、硫酸庆大霉素、消肿通乳、乳立通、乳宫菌毒康、乳炎神针与澳龙乳炎康的中度敏感率分别为43.75%、40.625%、15.625%、9.375%、6.25%、6.25%、3.125%。当各种西药浓度为20mg/mL时,本实选取的7种西药当中酮康唑的高敏率达100%,氟康唑的高敏率达96.88%;但牛场的16种药品的药效与药浓度为10mg/mL效果基本相当。在大蒜与黄连分别对白色念珠菌的最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC）的结果相比,发现大蒜比黄连的效果更好。通过ELISA对制备白色念珠菌的多克隆抗体效价测定,兔抗血清在稀释到1：32000、1：1400000时仍为阳性：抗体血清纯化后,通过核酸分析仪测定结果分别为：10.3mg/mL、22.28mg/mL。兔抗血清通过SDS-PAGE垂直电泳检测,可见特异性及纯度较高抗体条带。以葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等其它菌株为抗原,用间接ELISA法检测均无交叉反应现象。白色念珠菌免疫Balb/c小鼠60天后就可获得高免血清；进行细胞融合、筛选、获得较稳定的4株杂交瘤细胞株；诱导小鼠腹水,在7-10天获得腹水,其效价可达到1：102400以上。交叉反应实验显示：与葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等其它菌株无交叉反应现象。分别两次纯化单克隆抗体蛋白,其含量分别可达31.32mg/mL、27.65mg/mL。通过SDS-PAGE电泳检测显示,获得较高特异性及高纯度抗体条带。试纸条制备实验结果：制备出20nm的胶体金颗粒较稳定,选出抗体蛋白与胶体金结合最适宜pH值8～9,通过Mey氏稳定化试验选出了最适结合抗体蛋白量为20-40μg/mL。获得最佳稳定剂10% PEG20000。选出最优胶体金复合物缓冲液组分（Tris-HCl缓冲液、1%BSA、0.5% PEG20000、10%蔗糖、2%Tween-20）。用斑点金免疫渗滤试验（Dot Immunogold Filtration Assay, DIGFA）确定最适合结合NC膜的单克隆抗体及羊抗兔IgG包被量分别为1：2、1：16。分析膜封分别用3-5%的脱脂奶粉和BSA做闭液效果较好。试纸条检测灵敏度为2×102cfu·mL-1。试纸条在37℃条件下,保存10天后,试纸条的T线和C线显色变淡,在室温下条件下保存30天后,显色效果开始下降,而4℃条件下保存试纸条的稳定性依然较好。试纸条对其临床白色念珠菌检测的阳性符合率为86.67%（13/15）,阴性符合率为90%（9/10）。结论：本实验成功制备出诊断奶牛白色念珠菌性乳房炎的试纸条,为奶牛患白色念珠菌性乳房炎快速诊断提供了手段,但因缺乏临床试验,还有待临床应用检验。