蒜氨酸酶性质及无臭脱水蒜片生产工艺研究

论文摘要

大蒜中蒜氨酸酶（alliinase）是生成大蒜功能成分的关键酶,可催化S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜,即蒜氨酸（alliin）反应生成大蒜功能性物质。目前,有关温度、pH、E/S对蒜氨酸酶活性影响的研究较多,但有关金属离子对蒜氨酸酶活性作用机理的研究罕见报道。本研究以新鲜大蒜为原料,采用硫酸铵分级沉淀法、PEG6000沉淀法、葡聚糖G-200柱层析法提取分离蒜氨酸酶,用SDS-PAGE电泳鉴定其纯度,获得蒜氨酸酶提取分离纯化的适宜条件；利用正交试验、Box-behnken试验优化了金属离子对蒜氨酸酶活性影响的工艺参数；研究了金属离子对蒜氨酸酶反应动力学及紫外可见光谱的影响,初步探索了金属离子对蒜氨酸酶的激活与抑制机制。由于国内大部分热风干制蒜片产品品质较差,而高品质蒜片产品如冷冻干燥生产成本较高,本研究在单一干燥方式的基础上,采用真空微波-热风组合干燥技术研究开发高品质脱水蒜片。具体研究结果如下：1.蒜氨酸酶的提取分离对比实验表明,PEG6000沉淀法比硫酸铵沉淀法有更高的提取率,采用20%PEG6000纯化粗酶液,纯度是粗酶液的2.96倍,回收率达到72.75%；应用葡聚糖G-200柱层析纯化粗酶液,纯化后的酶液经SDS-PAGE电泳鉴定显示单一条带,凝胶成像系统分析其分子量约为54.7KD,这与文献报道值基本一致,说明本研究方法可有效纯化蒜氨酸酶。2.蒜氨酸酶性质研究在单因素试验的基础上进行正交及Box-behnken实验设计,优化金属离子激活蒜氨酸酶的参数,结果显示,E/S=0.20,反应温度36℃,pH为6.4,Mn2+浓度8.15mM时,蒜氨酸酶活性达到最大值,为0.156±0.0053umol/min。酶动力学试验结果显示,激活剂Mn2+使蒜氨酸酶的Km值、Vmax值变大,反应速度提高,这可能是Mn2+提供了适合蒜氨酸酶与底物反应的适宜环境,从而提高了反应速度；而抑制剂半胱氨酸使蒜氨酸酶Km、Vmax值减小,反应速度降低,这可能是因为半胱氨酸在这个反应体系中是一种反竞争性抑制剂,影响了酶与底物形成复合物向产物的转化,即反应过程中酶与底物结合形成中间复合物,复合物与反竞争性抑制剂半胱氨酸结合形成酶-底物-半胱氨酸复合物,而不能转化为产物,从而降低反应速度。紫外可见光谱试验结果显示,激活剂和抑制剂对特征吸收波长无影响,仅对吸收峰的大小有影响。添加激活剂Mn2+后,蒜氨酸酶在280nm、325nm以及430nm附近的吸收峰均变大；添加抑制剂半胱氨酸后,蒜氨酸酶在280nm、325nm附近吸收峰变大,在430nm处的吸收峰变小,这可能是因为激活剂和抑制剂影响了蒜氨酸酶辅助因子5’-磷酸吡哆醛的结构以及其与蒜氨酸酶主链的结合,从而影响了蒜氨酸酶的活性。初步探索了金属离子提高蒜氨酸酶活性的作用机制,探讨了蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量的关系,结果表明蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量呈正相关。3.无臭脱水蒜片的开发在护色与脱臭的基础上,采用真空微波-热风组合技术开发无臭脱水蒜片,以大蒜素含量、色值、复水率为指标,优化了组合干燥生产蒜片的最佳工艺参数：前期真空微波干燥20min（375w,真空度-90kpa）,后期热风干燥60min（60℃）,所得产品品质明显高于单一干燥方式的产品品质。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 大蒜成分及其功能作用
• 1.1 大蒜的化学成分
• 1.2 大蒜重要的生理功能
• 1.2.1 杀菌消炎作用
• 1.2.2 对心脑血管的作用
• 1.2.3 防癌抗癌作用
• 1.2.4 调节免疫功能
• 2 蒜氨酸酶的研究现状
• 2.1 蒜氨酸酶的分离纯化
• 2.2 蒜氨酸酶的结构
• 2.3 蒜氨酸酶的性质
• 2.3.1 催化反应机制
• 2.3.2 蒜氨酸酶的底物
• 2.3.3 蒜氨酸酶的动力学参数
• 2.3.4 蒜氨酸酶的最适温度
• 2.3.5 蒜氨酸酶的最适pH
• 2.3.6 影响蒜氨酸酶活性的因素
• 3 大蒜产业的现状及前景
• 3.1 大蒜油
• 3.1.1 水蒸气蒸馏法
• 3.1.2 有机溶剂浸出法
• 3.1.3 超临界二氧化碳萃取法
• 3.2 大蒜粉
• 3.2.1 热风干燥技术
• 3.2.2 真空微波干燥技术
• 3.2.3 真空冷冻干燥技术
• 3.2.4 组合干燥技术
• 3.3 无臭大蒜产品
• 3.3.1 钝化和抑制蒜氨酸酶的活性
• 3.3.2 冷冻脱臭法
• 3.3.3 吸附和溶解法
• 3.3.4 包埋法
• 4 主要研究内容
• 第二章 蒜氨酸酶的分离纯化
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 试剂的配置
• 1.4.2 蒜氨酸酶的提取
• 1.4.3 蒜氨酸酶的纯化
• 1.4.4 蒜氨酸酶纯度的鉴定及分子量测定
• 1.4.5 蒜氨酸酶底物的提取
• 1.4.6 蒜氨酸酶活性的测定
• 1.4.7 蛋白质含量的测定
• 1.5 数据处理与统计分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 硫酸铵固体分级沉淀法
• 2.2 PEG6000分级沉淀法
• 2.3 蒜氨酸酶的纯化
• 2.4 蒜氨酸酶纯度的鉴定及分子量测定
• 3. 本章小结
• 第三章 蒜氨酸酶性质研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 酶促反应最适E/S的确定
• 1.4.2 酶促反应最佳反应时间的确定
• 1.4.3 酶促反应最适反应温度的确定
• 1.4.4 酶促反应最适pH的确定
• 1.4.5 蒜氨酸酶的激活与抑制
• 1.4.6 Km及Vm的测定
• 1.4.7 蒜氨酸酶紫外可见光谱
• 1.4.8 蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量的关系
• 1.5 数据处理与统计分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 酶促反应最适E/S的确定
• 2.2 酶促反应最佳反应时间的确定
• 2.3 酶促反应最适温度的确定
• 2.4 酶促反应最适pH的确定
• 2.5 蒜氨酸酶的激活与抑制
• 2.5.1 金属离子对蒜氨酸酶的影响
• 2.5.2 金属离子互作正交试验
• 2.5.3 响应曲面法优化金属离子激活蒜氨酸酶的条件
• 2.5.4 Km及Vm的测定结果
• 2.5.5 蒜氨酸酶的紫外可见光谱分析
• 2.5.6 蒜氨酸酶活性与大蒜素生成量的关系
• 3. 本章小结
• 第四章 无臭脱水蒜片生产工艺研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 仪器设备
• 1.4 试验方法
• 1.4.1 蒜片护色
• 1.4.2 热风干燥试验
• 1.4.3 真空微波干燥试验
• 1.4.4 真空微波与热风组合干燥试验
• 1.4.5 真空冷冻干燥试验
• 1.5 测定指标与方法
• 1.5.1 色差的测定
• 1.5.2 蒜片中大蒜素的测定
• 1.5.3 干制蒜片复水率的测定
• 1.5.4 干制蒜片含水率的测定
• 1.6 数据处理与统计分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 复合护色液正交优化结果
• 2.2 热风干燥试验结果分析
• 2.2.1 热风干燥过程脱水速率曲线
• 2.2.2 热风温度对蒜片品质的影响
• 2.3 真空微波干燥试验结果分析
• 2.3.1 真空微波干燥脱水速率曲线
• 2.3.2 微波功率对蒜片品质的影响
• 2.4 真空微波与热风组合干燥试验结果分析
• 2.5 组合干燥与真空冷冻干燥试验结果分析
• 3. 本章小结
• 全文结论
• 创新点
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢