枯草芽胞杆菌BSn5中新型抑菌蛋白APn5的鉴定及性质研究

论文摘要

本论文共包括两部分工作,一部分是对枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）BSn5中新型抑菌蛋白APn5进行了鉴定及性质研究;另一部分是利用构建质粒物理图谱的方法,对苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株全基因组测序拼接中的pBMB69和pBMB95两个质粒进行了验证。1.枯草芽胞杆菌BSn5菌株是从被细菌污染的花魔芋愈伤组织中分离得到的对魔芋软腐病具有抑制作用的魔芋内生菌。利用饱和度为30%的硫酸铵从BSn5菌株的发酵上清液中沉淀胞外蛋白,利用不同截留量的超滤管进行超滤离心去除小分子物质,经SDS-PAGE检测,仅可见一条大小约为31.6 kDa的蛋白带,命名为APn5蛋白,对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种（Erwinia carotovora subsp.carotovora）SCG1具有较好的抑菌活性。APn5蛋白抑菌谱较窄,对所检测的真菌性植物病原菌具有微弱的抑菌活性,而在所检测的细菌性植物病原菌中,仅对胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种和带化红球菌（Rhodococcus fascians）具有较好的抑制作用。该蛋白对高温敏感,对蛋白酶E敏感,对蛋白酶K和胰蛋白酶部分敏感;在酸性环境下其抑菌活性稳定,碱性环境下活性不稳定。在菌株BSn5的生长周期中,该蛋白的抑菌活性不能稳定存在,其发酵上清液在对数生长期抑菌活性逐渐升高,进入稳定期后抑菌活性开始下降,直至完全消失。经调查,枯草芽胞杆菌B47也能产生与APn5分子量大小和抑菌活性均相似的抑菌蛋白,命名为APn5-like。利用APn5蛋白制备抗体,Western blot检测APn5-like蛋白,可获得阳性杂交信号。MALDI-TOF-MS和Q-TOF分析,未发现APn5蛋白和APn5-like蛋白与Matrix Science数据库中己知的蛋白具有高度相关性,它们具有两段完全一致的肽段,均与枯草芽胞杆菌鞭毛蛋白N端序列具有相似性,此外还具有功能相似的两个肽段,分别与DnaJ和金属结合蛋白具有相似性。综合理化性质和质谱分析结果,APn5蛋白和APn5-like蛋白为同一类抑菌蛋白,它们很可能是一种新功能的抗菌蛋白,具有自己的抑菌特点。2.苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520是从土壤中分离筛选,对棉铃虫、小菜蛾等鳞翅目害虫具有高毒力的专利菌株。本实验室利用全基因组鸟枪法测定了该菌株的全基因组序列,进行了初步分析,结果表明该菌株具有10个质粒。在质粒的测序拼接过程中,由于插入因子和重复序列的大量存在,导致在质粒的前后拼接结果有所不同。尤其是pBMB69和pBMB95是否是两个不同的质粒还是一个质粒上存在着很大分歧。在上述研究基础上,本研究利用构建质粒物理图谱的方法,对于苏云金芽胞杆菌YBT-1520测序拼接中前后拼接结果不同的质粒pBMB69和pBMB95以及plasmid137进行了验证。根据在质粒pBMB69和pBMB95的复制子ori44和ori60以及在这两个质粒上均存在的cry1Ac10基因序列设计引物,利用PCR的方法筛选已构建好的苏云金芽胞杆菌YBT-1520全基因组BAC文库。在筛选文库的过程中,共获得了9个可以同时扩增出ori44和cry1Ac10基因的转化子,1个可以同时扩增出ori60和cry1Ac10基因的转化子。利用NotⅠ对这些转化子进行酶切验证,从中筛选出装载的外源片段最大的转化子EMB2H05（含有pBMB69片段）和EMB2D10（含有pBMB95片段）。根据测序结果,选择合适的限制性内切酶进行酶切分析,利用琼脂糖凝胶普通电泳和脉冲电泳分析酶切片段并估计大小,最终构建物理图谱。本研究绘制出了质粒pBMB69的全部序列和pBMB95上重复区域的物理图谱。与测序拼接结果比较分析,pBMB69上有一段40 kb左右的片段发生了颠转,其余部分与拼接结果一致;pBMB95重复区域与测序拼接结果一致。结果表明,pBMB69与pBMB95为两个独立质粒。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 枯草芽胞杆菌BSn5中新型抑菌蛋白APn5的鉴定与性质研究
• 1.1 枯草芽胞杆菌中抗菌物质的研究进展
• 1.1.1 枯草芽胞杆菌的研究现状
• 1.1.1.1 枯草芽胞杆菌的特点
• 1.1.1.2 枯草芽胞杆菌防治植物病害的研究进展
• 1.1.1.3 枯草芽胞杆菌防治植物病害的机制
• 1.1.2 枯草芽胞杆菌的抗菌物质
• 1.1.2.1 低分子量抗菌肽和少量蛋白类抑菌物质
• 1.1.2.1.1 非核糖体途径合成的抗菌肽
• 1.1.2.1.2 核糖体途径合成的抗菌物质
• 1.1.2.2 其它非肽类抑菌物质
• 1.1.3 枯草芽胞杆菌BSn5中抑菌物质的研究目的和意义
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.1.1 菌株与质粒
• 1.2.1.2 培养基与培养条件
• 1.2.1.3 试剂
• 1.2.1.3.1 基本试剂
• 1.2.1.3.2 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳相关溶液
• 1.2.1.3.3 Western blot缓冲液
• 1.2.1.4 实验仪器
• 1.2.2 实验方法
• 1.2.2.1 枯草芽胞杆菌BSn5胞外蛋白的提取与纯化
• 1.2.2.1.1 枯草芽胞杆菌总蛋白的提取检测
• 1.2.2.1.2 枯草芽胞杆菌胞外蛋白的提取
• 1.2.2.1.3 抑菌蛋白APn5粗提液的截留纯化
• 1.2.2.2 SDS-PAGE电泳检测蛋白提取液
• 1.2.2.3 抑菌蛋白APn5溶液的浓度测定
• 1.2.2.3.1 牛血清白蛋白标准曲线的绘制
• 1.2.2.3.2 APn5蛋白溶液的浓度测定
• 1.2.2.4 抑菌蛋白APn5抑菌谱检测
• 1.2.2.5 抑菌蛋白APn5的性质检测
• 1.2.2.5.1 抑菌蛋白APn5热稳定性检测
• 1.2.2.5.2 抑菌蛋白APn5对蛋白酶敏感性检测
• 1.2.2.5.3 酸碱对APn5蛋白抑菌活性影响检测
• 1.2.2.6 枯草芽胞杆菌BSn5抑菌活性与生长状态的关系检测
• 1.2.2.7 抑菌蛋白APn5的质谱分析与氨基酸序列测定
• 1.2.2.8 枯草芽胞杆菌对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的活性调查
• 1.2.2.8.1 不同枯草芽胞杆菌菌株对SCG1的抑制作用
• 1.2.2.8.2 不同枯草芽胞杆菌胞外蛋白对SCG1的抑制作用
• 1.2.2.9 APn5蛋白在不同枯草芽胞杆菌中的分布调查
• 1.2.2.9.1 APn5蛋白抗血清的制备
• 1.2.2.9.2 Western blot检测方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 抑菌蛋白APn5的提取与活性分析
• 1.3.1.1 抑菌蛋白APn5的提取与截留纯化
• 1.3.1.2 抑菌蛋白APn5溶液的浓度测定
• 1.3.1.3 抑菌蛋白APn5的抑菌谱检测
• 1.3.2 抑菌蛋白APn5的性质分析
• 1.3.2.1 抑菌蛋白APn5对温度的敏感性
• 1.3.2.2 抑菌蛋白APn5对蛋白酶的敏感性
• 1.3.2.3 抑菌蛋白APn5对pH的敏感性
• 1.3.3 枯草芽胞杆菌BSn5抑菌活性与生长状态的关系
• 1.3.4 枯草芽胞杆菌对胡萝卜软腐欧文氏菌SCG1的活性调查
• 1.3.4.1 不同枯草芽胞杆菌菌株对SCG1的抑制作用
• 1.3.4.2 不同枯草芽胞杆菌胞外蛋白对SCG1的抑制作用
• 1.3.4.3 BSn5和B47胞外蛋白的检测
• 1.3.5 抑菌蛋白的质谱分析与氨基酸序列测定
• 1.4 讨论
• 参考文献
• 2 苏云金芽胞杆菌质粒pBMB69和pBMB95物理图谱的构建
• 2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的相关研究
• 2.1.1 细菌质粒的基本特征
• 2.1.1.1 质粒的复制方式
• 2.1.1.2 质粒的拷贝数
• 2.1.1.3 质粒的稳定性
• 2.1.1.4 质粒的不相容性
• 2.1.2 苏云金芽胞杆菌质粒的研究进展
• 2.1.2.1 苏云金芽胞杆菌质粒的多样性
• 2.1.2.2 苏云金芽胞杆菌质粒的分类
• 2.1.2.3 苏云金芽胞杆菌质粒的功能
• 2.1.2.4 苏云金芽胞杆菌YBT-1520质粒的研究进展
• 2.1.3 构建质粒pBMB69和pBMB95物理图谱的目的和意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株与质粒
• 2.2.1.2 培养基及培养条件
• 2.2.1.3 试剂
• 2.2.1.3.1 基本试剂
• 2.2.1.3.2 主要溶液和试剂的配制
• 2.2.2 实验器材
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 DNA的制备
• 2.2.3.1.1 大肠杆菌质粒的制备
• 2.2.3.1.2 苏云金芽胞杆菌总DNA的制备
• 2.2.3.1.3 DNA的纯化
• 2.2.3.2 DNA的电泳分析
• 2.2.3.3 DNA序列的测定与分析
• 2.2.3.4 PCR筛选BAC文库
• 2.2.3.5 BAC文库转化子外源片段末端测序
• 2.2.3.5.1 重组质粒的构建
• 2.2.3.5.2 重组质粒的转化
• 2.2.3.5.3 重组菌株的筛选
• 2.2.3.6 质粒的酶切与拼接
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 质粒pBMB69和pBMB95的序列特征
• 2.3.2 质粒pBMB69和pBMB95克隆重叠群的构建
• 2.3.2.1 YBT-1520全基因组BAC文库的筛选
• 2.3.2.2 BAC文库转化子末端序列的测定
• 2.3.3 质粒的物理图谱的构建
• 2.3.3.1 质粒pBMB69的物理图谱
• 2.3.3.2 质粒pBMB95的物理图谱
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录